牦牛乳外泌体miRNA缓解小肠上皮细胞缺氧损伤的作用机制

发布时间：2021-05-08 15:13

　　肠粘膜是维持肠道稳态的重要屏障。缺氧（Hypoxia,H）引发小肠上皮屏障功能损伤,修复能力下降,导致肠道疾病的发生。牛乳来源外泌体可以调节肠道健康,其中微小核糖核酸（micro RNAs,miRNAs）被认为是外泌体中潜在重要功能执行者。牦牛作为高原地区的生物,具有耐寒、抗缺氧、抗辐射等特性。我们猜测牦牛乳来源外泌体中miRNA能够缓解肠道缺氧损伤。本研究首先对牦牛乳外泌体（Yak milk exosome,Yak-Exo）提取方法进行优化。在此基础上,探讨分析牦牛乳外泌体调控大鼠小肠隐窝上皮细胞（The intestinal epithelium cells,IEC-6）缺氧损伤的作用,比较牦牛乳与荷斯坦奶牛乳外泌体中miRNA的差异,筛选牦牛乳外泌体中与缺氧相关miRNA。进一步阐明牦牛乳外泌体中bta-miR-31与bta-miR-34a调控IEC-6细胞缺氧损伤的分子机制。主要研究结果如下:1.牦牛乳外泌体提取方法的优化为了深入研究Yak-Exo中miRNA缓解肠道缺氧损伤的作用,首先需要获取高纯度的Yak-Exo。本研究以牦牛乳为研究对象,分别采用传统超高速离心法（Meth... 

【文章来源】：甘肃农业大学甘肃省

【文章页数】：110 页

【学位级别】：博士

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摘要
SUMMARY
英文缩略图表
第一章 绪论
    1.1 牦牛乳的特征组分和功能
    1.2 外泌体的来源、组分及功能
        1.2.1 外泌体的来源
        1.2.2 外泌体的组分
        1.2.3 食物来源外泌体的功能
    1.3 micro RNA的作用特点和机制
        1.3.1 micro RNA的生物合成
        1.3.2 micro RNA的作用机制
        1.3.3 食物来源miRNA的功能
    1.4 缺氧造成肠道损伤的分子机制
        1.4.1 肠道屏障功能与肠上皮细胞损伤的联系
        1.4.2 缺氧信号转导通路
        1.4.3 细胞凋亡信号转导通路
    1.5 立题依据
    1.6 研究目的和意义
    1.7 技术路线
第二章 牦牛乳外泌体提取方法的优化
    2.1 引言
    2.2 试验材料和方法
        2.2.1 主要仪器
        2.2.2 牛奶样品的准备
        2.2.3 Yak-Exo的提取方法优化和浓度检测
        2.2.4 Yak-Exo的鉴定
    2.3 结果与分析
        2.3.1 Exosomes浓度测定
        2.3.2 Exosomes透射电镜分析
        2.3.3 Exosomes的粒径分析
        2.3.4 Exosomes表征蛋白表达
        2.3.5 Exosomes流式分析
    2.4 讨论
        2.4.1 牦牛乳外泌体提取方法的优化
        2.4.2 牛乳外泌体的鉴定
    2.5 结论
第三章 牦牛乳外泌体缓解小肠上皮细胞缺氧损伤的影响
    3.1 引言
    3.2 试验材料和方法
        3.2.1 主要仪器
        3.2.2 样品的准备
        3.2.3 Yak-Exo与 Cow-Exo的提取和浓度检测
        3.2.4 Yak-Exo的鉴定
        3.2.5 大鼠小肠隐窝上皮细胞的培养
        3.2.6 MTT法检测细胞增殖
        3.2.7 IEC-6 细胞对外泌体的摄取试验
        3.2.8 Western Blot检测
    3.3 结果与分析
        3.3.1 牦牛乳与荷斯坦奶牛乳外泌体特征比较
        3.3.2 牦牛乳外泌体对IEC-6 细胞增殖的影响
        3.3.3 牦牛乳外泌体对IEC-6 细胞内吞的影响
        3.3.4 牦牛乳外泌体对IEC-6 细胞中p53和HIF信号蛋白影响
    3.4 讨论
        3.4.1 牦牛乳外泌体形态特征
        3.4.2 牦牛乳外泌体缓解IEC-6 细胞缺氧损伤影响
        3.4.3 IEC-6 细胞摄取牦牛乳外泌体的影响
        3.4.4 牦牛乳外泌体调节p53和HIF信号蛋白缓解IEC-6 细胞缺氧损伤影响
    3.5 结论
第四章 牦牛乳与荷斯坦奶牛乳外泌体中microRNAs的分析与鉴定
    4.1 引言
    4.2 试验材料和方法
        4.2.1 主要仪器
        4.2.2 Yak-Exo和 Cow-Exo样品的准备
        4.2.3 Yak-Exo和 Cow-Exo中 miRNA提取及质量鉴定
        4.2.4 文库构建、测序及数据分析
        4.2.5 PCR验证
    4.3 结果与分析
        4.3.1 总RNA浓度检测结果
        4.3.2 测序数据概述及特征
        4.3.3 差异表达miRNA荧光定量验证
    4.4 讨论
    4.5 结论
第五章 bta-miR-31和bta-miR-34a缓解IEC-6 细胞缺氧损伤的影响
    5.1 引言
    5.2 试验材料和方法
        5.2.1 大鼠小肠隐窝上皮细胞的培养
        5.2.2 细胞转染
        5.2.3 PCR验证
        5.2.4 MTT法检测细胞增殖
        5.2.5 免疫荧光检测
        5.2.6 Western Blot检测
        5.2.7 双荧光素酶验证靶基因
    5.3 结果与分析
        5.3.1 转染效率检测
        5.3.2 bta-miR-31 对缺氧诱导下IEC-6 细胞生存能力的影响
        5.3.3 bta-miR-34a对缺氧诱导下IEC-6 细胞生存能力的影响
        5.3.4 bta-miR-31 对缺氧诱导HIF信号通路蛋白的调控作用
        5.3.5 bta-miR-31 对缺氧诱导下细胞凋亡信号通路蛋白的调控作用
        5.3.6 bta-miR-34a对缺氧诱导下HIF信号通路蛋白的调控作用
        5.3.7 bta-miR-34a对缺氧诱导下抗凋亡p53 信号通路蛋白的调控作用
        5.3.8 bta-miR-31与miR-34a靶基因预测
    5.4 讨论
        5.4.1 bta-miR-31/34a对缺氧诱导下IEC-6 细胞生存能力的影响
        5.4.2 bta-miR-31/34a对缺氧诱导下HIF信号通路蛋白的调控作用
        5.4.3 bta-mi R-31/34a 对缺氧诱导下细胞凋亡信号通路蛋白的调控作用
        5.4.4 bta-mi R-31与 bta-mi R-34靶基因预测
    5.5 结论
第六章 全文总结与创新点
参考文献
致谢
作者简历
导师简介


【参考文献】：
期刊论文
[1]牦牛乳物理化学特性的研究进展[J]. 李海梅,何胜华,刘天一,马莺.  中国乳品工业. 2009(08)
[2]Mechanisms of caspase activation and inhibition during apoptosis[J].   Cell Research. 2002(Z1)
[3]中国的牦牛资源[J]. 陆仲磷.  中国草食动物. 1999(02)
[4]长期居住海平后藏族经受急性减压低氧时的心泵和呼吸功能[J]. 周兆年,王利华,袁锋,姜楞,潘翠珍,何军.  科学通报. 1992(03)

博士论文
[1]青藏高原高寒植物及牦牛奶抗氧化特性研究[D]. 崔光欣.兰州大学 2016
[2]大熊猫不同泌乳期乳汁microRNA表达谱研究[D]. 王承东.四川农业大学 2015

硕士论文
[1]牦牛MMP3、ADAM17、ARG2基因SNPs与其高原低氧适应性相关分析[D]. 周长卿.甘肃农业大学 2014



本文编号：3175559