黄酒中生物胺代谢合成微生物群落初步探究
发布时间：2022-01-01 23:02
生物胺是黄酒中的主要危害物之一,主要由乳酸菌产生的氨基酸脱羧酶作用于相应的氨基酸前体产生,解析黄酒中生物胺的生成机制及其与乳酸菌群落之间的关系对于黄酒的安全酿造至关重要。本文针对工业级别半干型黄酒酿造,深入研究了乳酸菌在黄酒酿造过程中的动态变化规律,明晰了乳酸菌与生物胺之间的关系。针对生物胺产生菌进行高通量筛选,研究不同酿造环境因素对其产胺的影响,为黄酒酿造过程中生物胺的降低提供了理论依据。最后构建含有不产生物胺乳酸菌和产生物胺乳酸菌的合成微生物群落,进一步揭示了黄酒中乳酸菌之间的相互作用关系及其对生物胺生成的影响。主要研究结论如下:（1）建立了一种基于叠氮溴化丙锭预处理结合荧光定量PCR检测乳酸菌活菌数的方法,该方法特异性好,灵敏度高(检测限为4.0×101-1.7×103 CFU?mL-1),重复性好（Cq值变异系数小于1.5%）,与平板计数相比差异不显著（统计学上）,P>0.05,为解析样品中乳酸菌的实时组成及检测具有活性但不可培养（Viable but nonculturable,VBNC）状态的乳酸菌提供...
【文章来源】：江南大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：58 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
高通量筛选流程图
江南大学硕士学位论文16图3-1PMA优化结果.(a)PMA浓度对死菌DNA的抑制率；(b)暗孵育时间和曝光时间对死菌DNA的抑制率Figure3-1ResultsofPMAtreatment.(a)InhibitingeffectofPMAconcentrationonDNAofnon-viablebacteria;(b)InhibitingeffectofincubationandphotoactivationtimeonDNAofnon-viablebacteria3.1.1.2引物特异性减少或消除引物的非特异性结合是提高qPCR法检测生物量准确度的关键[78]。silicoPCR(http://insilico.ehu.es/PCR/)结果显示所有引物仅与靶细菌结合，扩增出相应的目标片段，NCBI、RDP和TestPrime等数据库检索发现所有引物具有良好的特异性。进一步的通过qPCR实验对引物的特异性进行实验验证，结果见表3-1。在实验过程中引物A(LactoF/LactoR)、J(LactisF/LactisR)、K(Ent1/Ent2)出现了一定的非特异性结合，具体表现为引物A与非乳杆菌属的Weissellaparamesenteroides和部分Enterococcus（10株中的8株），引物J与1株非乳球菌属的Streptococcusthermophilus，引物K与非肠球菌属的部分Lactobacillussp.（4株中的1株）结合，显示出扩增信号。剩余引物对非靶细菌表现出了良好的排他性，与靶细菌则显示出了良好的扩增信号，熔解曲线单一。引物A和J是基于16SrRNA基因设计的引物，16SrRNA基因是最常用于细菌鉴定与检测的核酸序列，也是qPCR法检测细菌含量最常用的区域。合理利用16SrRNA基因的不同分区[79]，能够较为准确的区分不同细菌。但同一个种属细菌的16SrRNA基因往往具有较高的相似性，这使得在菌种水平乃至菌株水平上区分不同的细菌具有一定的难度。近年来，大量基于16S23SrRNA基因间区[80]、23SrRNA基因[81]以及各种管家基因[60]的引物被设计出来并用于细菌的检测，大大提高了检测的准确度。本文中基于recA基因设计?
第三章结果与讨论19图3-2PMA-qPCR法的可靠性检测.(a)变异系数；(b)显著性检验Figure3-2ReliabilityofPMA-qPCR.(a)Variationcoefficients;(b)Significancetest3.1.3黄酒酿造过程中乳酸菌演替规律3.1.3.1乳酸菌活菌数检测使用建立好的PMA-qPCR检测法对不同时间点黄酒醪液中乳酸菌的活菌数进行了定量检测，结果如图3-3所示。乳杆菌属在乳酸菌中占有绝对优势，约占69.88%96.45%，其次是乳球菌属(2.75%28.44%)和肠球菌属(0.35%5.27%)，魏斯氏菌属在黄酒整个酿造过程中都具有较低的含量。黄酒中乳酸菌活菌数呈逐渐下降趋势，发酵第3d时约为1.5×106CFUmL1，到发酵第18d时仅剩约1.2×105CFUmL1，较低的乳酸菌含量可能与较低的核酸提取率有关(17.335.7ngμL1)。尽管黄酒发酵后期依然含有丰富的营养物质[5]，但此时的环境状态已不再适合乳酸菌的生长繁殖，过高的乙醇浓度和过低的pH等都会降低细菌活性，使其进入休眠期甚至死亡。前期研究发现尽管在黄酒发酵后期，生物胺的含量仍呈现缓慢上升趋势，但生物胺生生成速率从第7d开始已降至0.3mgL1d1以下[10]。进一步针对黄酒中的优势乳酸菌-乳杆菌属，在种水平上进行了活菌检测，结果
【参考文献】：
期刊论文
[1]黄酒酿造过程中产生物胺菌株的筛选及其特性研究[J]. 曹利瑞,熊智强,朱松,王光强,夏永军,王巧惠,艾连中. 中国食品学报. 2018(06)
[2]孝感米酒中乳酸菌的分离及其对黄酒品质的影响[J]. 杨小丽,高航,徐宝钗,赵慧君,马佳佳,张振东. 食品工业科技. 2018(18)
[3]酱醪细菌菌株的分离及功能分析[J]. 胡传旺,李巧玉,周朝晖,李铁桥,陈坚,堵国成,方芳. 微生物学通报. 2017(08)
[4]黄酒中乳酸菌的研究进展[J]. 莫依灿,钟伟俊,何湛,赵文红,黄敏欣,白卫东. 中国酿造. 2015(09)
[5]白酒发酵与蒸馏过程中5种生物胺变化[J]. 范文来,徐岩,温永柱. 食品工业科技. 2015(09)
[6]传统香肠中产生物胺肠细菌和乳酸菌分离方法的研究[J]. 卢士玲,李开雄,徐幸莲,李蕊婷,马宇霞,李宝坤. 食品与发酵工业. 2012(08)
[7]试论乳酸菌与白酒酿造的关系[J]. 沈怡方. 黑龙江发酵. 1981(03)
博士论文
[1]基于NMR的乳酸菌生物胺通路的代谢组学分析及安全性评价中的应用[D]. 钟凯.中国疾病预防控制中心 2009
硕士论文
[1]绍兴机械化黄酒风味形成途径和功能微生物的研究[D]. 陈青柳.江南大学 2018
[2]黄酒乳酸菌酸化发酵对降低生物胺的影响[D]. 魏晓璐.江南大学 2017
[3]黄酒陈酿过程中酸败乳酸菌的分离鉴定及其特性研究[D]. 刘文容.江南大学 2017
[4]芝麻香型白酒发酵过程中乳酸菌群结构及功能[D]. 邢敏钰.江南大学 2017
[5]一株弯曲乳杆菌腐胺生成途径及其调控的研究[D]. 王然然.江南大学 2017
[6]环境因素对屎肠球菌产酪胺的影响研究[D]. 王俊朋.天津科技大学 2017
[7]黄酒曲中微生物菌群结构分析及生物胺产生菌的分离鉴定[D]. 胡翠翠.天津科技大学 2017
本文编号：3562993
【文章来源】：江南大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：58 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
高通量筛选流程图
江南大学硕士学位论文16图3-1PMA优化结果.(a)PMA浓度对死菌DNA的抑制率；(b)暗孵育时间和曝光时间对死菌DNA的抑制率Figure3-1ResultsofPMAtreatment.(a)InhibitingeffectofPMAconcentrationonDNAofnon-viablebacteria;(b)InhibitingeffectofincubationandphotoactivationtimeonDNAofnon-viablebacteria3.1.1.2引物特异性减少或消除引物的非特异性结合是提高qPCR法检测生物量准确度的关键[78]。silicoPCR(http://insilico.ehu.es/PCR/)结果显示所有引物仅与靶细菌结合，扩增出相应的目标片段，NCBI、RDP和TestPrime等数据库检索发现所有引物具有良好的特异性。进一步的通过qPCR实验对引物的特异性进行实验验证，结果见表3-1。在实验过程中引物A(LactoF/LactoR)、J(LactisF/LactisR)、K(Ent1/Ent2)出现了一定的非特异性结合，具体表现为引物A与非乳杆菌属的Weissellaparamesenteroides和部分Enterococcus（10株中的8株），引物J与1株非乳球菌属的Streptococcusthermophilus，引物K与非肠球菌属的部分Lactobacillussp.（4株中的1株）结合，显示出扩增信号。剩余引物对非靶细菌表现出了良好的排他性，与靶细菌则显示出了良好的扩增信号，熔解曲线单一。引物A和J是基于16SrRNA基因设计的引物，16SrRNA基因是最常用于细菌鉴定与检测的核酸序列，也是qPCR法检测细菌含量最常用的区域。合理利用16SrRNA基因的不同分区[79]，能够较为准确的区分不同细菌。但同一个种属细菌的16SrRNA基因往往具有较高的相似性，这使得在菌种水平乃至菌株水平上区分不同的细菌具有一定的难度。近年来，大量基于16S23SrRNA基因间区[80]、23SrRNA基因[81]以及各种管家基因[60]的引物被设计出来并用于细菌的检测，大大提高了检测的准确度。本文中基于recA基因设计?
第三章结果与讨论19图3-2PMA-qPCR法的可靠性检测.(a)变异系数；(b)显著性检验Figure3-2ReliabilityofPMA-qPCR.(a)Variationcoefficients;(b)Significancetest3.1.3黄酒酿造过程中乳酸菌演替规律3.1.3.1乳酸菌活菌数检测使用建立好的PMA-qPCR检测法对不同时间点黄酒醪液中乳酸菌的活菌数进行了定量检测，结果如图3-3所示。乳杆菌属在乳酸菌中占有绝对优势，约占69.88%96.45%，其次是乳球菌属(2.75%28.44%)和肠球菌属(0.35%5.27%)，魏斯氏菌属在黄酒整个酿造过程中都具有较低的含量。黄酒中乳酸菌活菌数呈逐渐下降趋势，发酵第3d时约为1.5×106CFUmL1，到发酵第18d时仅剩约1.2×105CFUmL1，较低的乳酸菌含量可能与较低的核酸提取率有关(17.335.7ngμL1)。尽管黄酒发酵后期依然含有丰富的营养物质[5]，但此时的环境状态已不再适合乳酸菌的生长繁殖，过高的乙醇浓度和过低的pH等都会降低细菌活性，使其进入休眠期甚至死亡。前期研究发现尽管在黄酒发酵后期，生物胺的含量仍呈现缓慢上升趋势，但生物胺生生成速率从第7d开始已降至0.3mgL1d1以下[10]。进一步针对黄酒中的优势乳酸菌-乳杆菌属，在种水平上进行了活菌检测，结果
【参考文献】：
期刊论文
[1]黄酒酿造过程中产生物胺菌株的筛选及其特性研究[J]. 曹利瑞,熊智强,朱松,王光强,夏永军,王巧惠,艾连中. 中国食品学报. 2018(06)
[2]孝感米酒中乳酸菌的分离及其对黄酒品质的影响[J]. 杨小丽,高航,徐宝钗,赵慧君,马佳佳,张振东. 食品工业科技. 2018(18)
[3]酱醪细菌菌株的分离及功能分析[J]. 胡传旺,李巧玉,周朝晖,李铁桥,陈坚,堵国成,方芳. 微生物学通报. 2017(08)
[4]黄酒中乳酸菌的研究进展[J]. 莫依灿,钟伟俊,何湛,赵文红,黄敏欣,白卫东. 中国酿造. 2015(09)
[5]白酒发酵与蒸馏过程中5种生物胺变化[J]. 范文来,徐岩,温永柱. 食品工业科技. 2015(09)
[6]传统香肠中产生物胺肠细菌和乳酸菌分离方法的研究[J]. 卢士玲,李开雄,徐幸莲,李蕊婷,马宇霞,李宝坤. 食品与发酵工业. 2012(08)
[7]试论乳酸菌与白酒酿造的关系[J]. 沈怡方. 黑龙江发酵. 1981(03)
博士论文
[1]基于NMR的乳酸菌生物胺通路的代谢组学分析及安全性评价中的应用[D]. 钟凯.中国疾病预防控制中心 2009
硕士论文
[1]绍兴机械化黄酒风味形成途径和功能微生物的研究[D]. 陈青柳.江南大学 2018
[2]黄酒乳酸菌酸化发酵对降低生物胺的影响[D]. 魏晓璐.江南大学 2017
[3]黄酒陈酿过程中酸败乳酸菌的分离鉴定及其特性研究[D]. 刘文容.江南大学 2017
[4]芝麻香型白酒发酵过程中乳酸菌群结构及功能[D]. 邢敏钰.江南大学 2017
[5]一株弯曲乳杆菌腐胺生成途径及其调控的研究[D]. 王然然.江南大学 2017
[6]环境因素对屎肠球菌产酪胺的影响研究[D]. 王俊朋.天津科技大学 2017
[7]黄酒曲中微生物菌群结构分析及生物胺产生菌的分离鉴定[D]. 胡翠翠.天津科技大学 2017
本文编号：3562993
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/qgylw/3562993.html
