黄曲霉毒素M 1 两种高灵敏度酶免疫检测方法的建立及其双特异性抗体的制备

发布时间：2022-12-09 02:21

　　本文在对各个反应体系优化的基础上,建立了黄曲霉毒素M₁（Aflatoxin M₁,AFM₁）的两种酶免疫学检测方法,包括联免疫吸附分析法（Enzyme-linked Immunosorbent Assay,ELISA）和化学发光酶联免疫吸附分析法（Chemiluminescence immunoassay,CLEIA）并通过免疫亲和柱-高效液相色谱法进行方法学评估。此外,在AFM₁单抗的基础上,通过细胞融合法探索制备抗黄曲霉毒素M₁（AFM₁）/抗辣根过氧化物酶（HRP）的双特异性抗体,以建立基于双特异性抗体的AFM₁-ELISA提高AFM₁检测方法的灵敏度。1.酶联免疫吸附分析法的建立采用碳二亚胺法将AFM₁与载体蛋白BSA偶联,并将偶联产物通过紫外扫描鉴定AFM₁与BSA特征吸收峰,成功制备了AFM₁-BSA人工抗原;并通过优化ELISA反应体... 

【文章页数】：74 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第1章 绪论
    1.1黄曲霉毒素M_1的概述
        1.1.1 黄曲霉毒素M_1 的理化性质
        1.1.2 黄曲霉毒素M_1 的危害
        1.1.3 黄曲霉毒素M_1 的限量标准
        1.1.4 黄曲霉毒素M_1 的来源
    1.2黄曲霉毒素M_1检测方法与研究现状
        1.2.1 薄层色谱法(Thin Layer Chromatography,TLC)
        1.2.2 高效液相色谱法(High performance liquid chromatography)
        1.2.3 免疫分析法(Immunoassay)
            1.2.3.1 放射免疫分析法(Radioimmunoassay)
            1.2.3.2 酶联免疫吸附方法(Enzyme-linked Immunosorbent Assay)
            1.2.3.3 胶体金免疫层析法(Gold immunochromatography assay)..
            1.2.3.4 时间分辨荧光免疫分析法(Time-resolved fluorescenceimmunoassay,TRFIA)
            1.2.3.5 量子点标记免疫分析法(Quantum dot immunoassay)
        1.2.4 化学发光法(ChemiLuminescence,CL)
            1.2.4.1 直接标记化学发光
            1.2.4.2 酶联免疫化学发光
            1.2.4.3 电化学发光
    1.3 双特异性抗体的概述
        1.3.1 双特异性抗体的制备方法
        1.3.2 双特异性抗体的应用
    1.4 本课题的研究意义
    1.5 本课题的研究目的与内容
第2章 黄曲霉毒素M_1 酶联免疫吸附分析方法的建立
    2.1 实验试剂与仪器
        2.1.1 实验主要试剂
        2.1.2 实验器材
        2.1.3 实验所用溶液的配制
    2.2 实验方法
        2.2.1 AFM_1-BSA人工抗原的制备
        2.2.2 最佳抗原包被浓度与抗体工作浓度的确定
        2.2.3 酶标二抗最佳工作浓度的确定
        2.2.4 间接竞争ELISA方法
        2.2.5 标准品配制液的优化
        2.2.6 AFM_1-ELISA标准曲线的建立
        2.2.7 样品提取方法的优化
        2.2.8 样品的加标回收
    2.3 实验结果与分析
        2.3.1 AFM_1 完全抗原的合成结果
        2.3.2 抗原抗体工作浓度的确定
        2.3.3 酶标二抗浓度的优化
        2.3.4 标准品配制液的优化结果
        2.3.5 标准曲线的建立
        2.3.6 样品提取方法的优化结果
        2.3.7 样品的加标回收结果
    2.4 本章小结
第3章 黄曲霉毒素M_1 化学发光酶联免疫分析方法的建立
    3.1 实验材料与仪器
        3.1.1 实验主要试剂
        3.1.2 实验器材
        3.1.3 实验所需溶液的配制
    3.2 实验方法
        3.2.1 抗原包被浓度的选择
        3.2.2 CLEIA反应体系优化
        3.2.3 标准曲线的建立
        3.2.4 在奶制品中的加标回收测定
    3.3 实验结果与分析
        3.3.1 抗原最佳包被浓度的确定
        3.3.2 抗体最佳结合浓度的确定
        3.3.3 酶标二抗浓度的优化
        3.3.4 离子强度对CLEIA的影响
        3.3.5 PH对CLEIA的影响
        3.3.6 有机溶剂对CLEIA的影响
        3.3.7 CLEIA工作曲线范围的确定
        3.3.8 样品的加标回收
    3.4 本章小结
第4章 黄曲霉毒素M_1 免疫亲和柱-高效液相色谱法的建立
    4.1 实验材料仪器
        4.1.1 实验主要试剂
        4.1.2 实验器材
    4.2 实验方法
        4.2.1 色谱条件
        4.2.2 标准曲线的绘制
        4.2.3 样品的净化
        4.2.4 上样缓冲液的优化
        4.2.5 样品的前处理与加标回收
        4.2.6 实际样品的检测
    4.3 实验结果与分析
        4.3.1 标准曲线的建立
        4.3.2 上样缓冲液的优化结果
        4.3.3 样品的加标回收
        4.3.4 ELISA 、CLEIA与HPLC的方法学比较
        4.3.5 未知奶制品中AFM_1 含量检测
    4.4 本章小结
第5章 抗黄曲霉毒素M_1/抗辣根过氧化物酶双特异性抗体的制备
    5.1 实验材料与仪器
        5.1.1 实验动物与细胞
        5.1.2 实验主要试剂
        5.1.3 实验器材
        5.1.4 实验溶液的配制
    5.2 实验方法
        5.2.1 小鼠免疫
        5.2.2 小鼠血清效价测定
        5.2.3 双特异性抗体的制备
            5.2.3.1 抗AFM_1 杂交瘤细胞的次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)缺陷型细胞的诱导
            5.2.3.2 免疫小鼠脾细胞的准备
            5.2.3.3 细胞电融合
        5.2.4 杂交瘤细胞的筛选与克隆
    5.3 实验结果与分析
        5.3.1 AFM_1-3F12 细胞复状结果
        5.3.2 免疫小鼠血清效价的测定结果
        5.3.3 AFM_1 细胞HGPRT缺陷型的诱导结果
        5.3.4 三瘤杂交细胞的筛选
        5.3.5 三瘤杂交细胞的克隆化结果
    5.4 本章小结
第6章 结论与展望
    6.1 结论
    6.2 展望
参考文献
攻读学位期间的研究成果及所获荣誉
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]液相色谱-质谱/质谱法检测生鲜乳中黄曲霉素M1方法的建立[J]. 张俊,赵玉玺,张爱凤,闫跃飞,闫磊,张震.  黑龙江畜牧兽医. 2018(07)
[2]双特异性抗体的结构及应用研究进展[J]. 房世娣,毛晓燕.  微生物学免疫学进展. 2018(02)
[3]双特异性抗体mAb04-MICA对人白血病细胞K562的体内外抗肿瘤活性[J]. 杜晓典,孙福谋,袁敏讷,王斐,刘雅利,尚鹏钊,王旻,张娟.  中国药科大学学报. 2018(01)
[4]同位素稀释液相色谱-串联质谱法测定婴儿辅食中的黄曲霉毒素M[J]. 罗兰,任燕,黄承鹏.  现代预防医学. 2018(02)
[5]双特异性抗体药物在抗肿瘤治疗中的应用[J]. 袁庆云,侯维花,孙祖俊,于敏.  药物生物技术. 2017(06)
[6]超高效液相色谱法同时测定乳及乳饮料中黄曲霉毒素M1和B1[J]. 李可,丘汾,梁肇海,温权.  职业与健康. 2017(24)
[7]黄曲霉毒素B1人工抗原的制备、鉴定与免疫特性研究[J]. 陈宇熹,方振霞,雷美玲,吴艺岚,张月珠,牛蓉,叶舟.  武夷科学. 2017(00)
[8]黄曲霉毒素M1酶联免疫吸附检测方法的建立[J]. 卢晓霞,谢海军,宋崴,赵邑,何永吉.  食品工程. 2017(02)
[9]双特异性抗体药物特征及其在肺癌治疗中的研究进展[J]. 姬时宇,崔月倩,赵磊,胡毅.  解放军医学院学报. 2017(09)
[10]乳及乳制品中黄曲霉毒素M1研究进展[J]. 高亚男,王加启,郑楠.  动物营养学报. 2017(07)



本文编号：3714619