聚多巴胺-荧光适配体传感器的构建及其在甲壳类精氨酸激酶检测中的应用
发布时间：2022-12-23 04:03
近年来,对水产品及其制品中的致敏原过敏的人群日益增多。由于缺乏有效的治疗手段,避免摄入相关食物致敏原仍是预防食物过敏的主要途径。这就需要对食品中潜在的致敏原进行快速高效的检测及标识。精氨酸激酶（Arginine kinase,AK）是甲壳类食品的主要致敏原之一。目前,精氨酸激酶的检测方法主要为PCR法和质谱分析法。然而这两种方法操作复杂,成本较高,且易出现假阳性结果。因此基于上述问题,本研究旨在构建出一种操作简单,准确灵敏,低廉环保的甲壳类精氨酸激酶检测方法。研究的主要内容如下:1、本文通过硫酸铵沉淀法及阴离子交换柱纯化得到精氨酸激酶;液相质谱联用法鉴定该蛋白为凡纳滨对虾中的精氨酸激酶;MALDI-TOF测定其分子量为39675 Da。对提取的精氨酸激酶的氨基酸组成进行分析,显示含量最高的氨基酸分别为天冬氨酸、谷氨酸和赖氨酸。通过紫外可见光光谱结果显示精氨酸激酶在210 nm和280 nm具有两个特征吸收峰。通过圆二色光谱结果显示,精氨酸激酶的二级结构中α螺旋占64%,β片层占11%,其余占25%。通过ELISA分析法证明提取的精氨酸激酶具有致敏性。通过多方面实验确定精氨酸激酶的结构及...
【文章页数】：102 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
中文摘要
英文摘要
中英文对照表
第1章 引言
1.1 甲壳类水产品过敏及检测概况
1.1.1 甲壳类致敏原的过敏反应机制
1.1.2 甲壳类主要致敏原
1.1.3 甲壳类致敏原检测方法研究进展
1.2 核酸适配体在食品安全检测中的应用进展
1.2.1 核酸适配体概述
1.2.2 核酸适配体在食品安全检测中的应用进展
1.3 聚多巴胺在生物传感中的应用进展
1.3.1 聚多巴胺概述
1.3.2 聚多巴胺在生物传感中的应用进展
1.4 主要研究内容与意义
1.4.1 研究意义及目的
1.4.2 研究内容
1.4.3 技术路线
第2章 精氨酸激酶纯化、鉴定及结构分析
2.1 前言
2.2 仪器与试剂
2.2.1 实验仪器
2.2.2 材料与试剂
2.2.3 溶液的配制
2.3 实验方法
2.3.1 精氨酸激酶的粗提
2.3.2 精氨酸激酶的纯化
2.3.3 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)电泳分析
2.3.4 精氨酸激酶质谱鉴定
2.3.5 精氨酸激酶紫外光谱分析
2.3.6 精氨酸激酶结构分析
2.3.7 酶联免疫吸附实验(ELISA)
2.4 结果与讨论
2.4.1 精氨酸激酶的提纯
2.4.2 SDS-PAGE分析精氨酸激酶纯度
2.4.3 精氨酸激酶质谱分析
2.4.4 紫外可见光光谱分析
2.4.5 精氨酸激酶结构分析
2.4.6 精氨酸激酶免疫原性分析
2.5 小结
第3章 磁珠-SELEX筛选精氨酸激酶核酸适配体
3.1 前言
3.2 仪器与试剂
3.2.1 实验仪器
3.2.2 材料与试剂
3.2.3 溶液的配制
3.2.4 随机核苷酸文库和引物的构建
3.3 实验方法
3.3.1 AK与氨基磁珠的偶联
3.3.2 SELEX体外筛选
3.3.3 PCR扩增体系和反应条件优化
3.3.4 适配体的克隆、测序
3.3.5 核酸适配体的亲和性试验
3.3.6 核酸适配体的特异性试验
3.4 结果与讨论
3.4.1 AK偶联磁珠的表征
3.4.2 磁珠-SELEX筛选条件优化
3.4.3 筛选轮数的确定
3.4.4 测序结果分析及二级结构预测
3.4.5 核酸适配体亲和力测定
3.4.6 核酸适配体特异性分析
3.5 小结
第4章 聚多巴胺-荧光适配体传感器在甲壳类精氨酸激酶检测中的应用
4.1 前言
4.2 仪器与试剂
4.2.1 实验仪器
4.2.2 材料与试剂
4.2.3 溶液配制
4.3 实验方法
4.3.1 聚多巴胺的合成及表征
4.3.2 聚多巴胺探针的合成
4.3.3 方法学考察
4.3.4 样品预处理
4.3.5 实际样品的检测
4.4 结果与讨论
4.4.1 聚多巴胺的合成及理化性质表征
4.4.2 聚多巴胺探针的构建与优化
4.4.3 生物传感器的构建表征及方法学考察
4.4.5 实际样品的蛋白分析及精氨酸激酶的检测
4.5 小结
第5章 结论与展望
5.1 总结
5.2 创新点
5.3 展望
参考文献
致谢
本文编号：3724676
【文章页数】：102 页
【学位级别】：硕士
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中文摘要
英文摘要
中英文对照表
第1章 引言
1.1 甲壳类水产品过敏及检测概况
1.1.1 甲壳类致敏原的过敏反应机制
1.1.2 甲壳类主要致敏原
1.1.3 甲壳类致敏原检测方法研究进展
1.2 核酸适配体在食品安全检测中的应用进展
1.2.1 核酸适配体概述
1.2.2 核酸适配体在食品安全检测中的应用进展
1.3 聚多巴胺在生物传感中的应用进展
1.3.1 聚多巴胺概述
1.3.2 聚多巴胺在生物传感中的应用进展
1.4 主要研究内容与意义
1.4.1 研究意义及目的
1.4.2 研究内容
1.4.3 技术路线
第2章 精氨酸激酶纯化、鉴定及结构分析
2.1 前言
2.2 仪器与试剂
2.2.1 实验仪器
2.2.2 材料与试剂
2.2.3 溶液的配制
2.3 实验方法
2.3.1 精氨酸激酶的粗提
2.3.2 精氨酸激酶的纯化
2.3.3 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)电泳分析
2.3.4 精氨酸激酶质谱鉴定
2.3.5 精氨酸激酶紫外光谱分析
2.3.6 精氨酸激酶结构分析
2.3.7 酶联免疫吸附实验(ELISA)
2.4 结果与讨论
2.4.1 精氨酸激酶的提纯
2.4.2 SDS-PAGE分析精氨酸激酶纯度
2.4.3 精氨酸激酶质谱分析
2.4.4 紫外可见光光谱分析
2.4.5 精氨酸激酶结构分析
2.4.6 精氨酸激酶免疫原性分析
2.5 小结
第3章 磁珠-SELEX筛选精氨酸激酶核酸适配体
3.1 前言
3.2 仪器与试剂
3.2.1 实验仪器
3.2.2 材料与试剂
3.2.3 溶液的配制
3.2.4 随机核苷酸文库和引物的构建
3.3 实验方法
3.3.1 AK与氨基磁珠的偶联
3.3.2 SELEX体外筛选
3.3.3 PCR扩增体系和反应条件优化
3.3.4 适配体的克隆、测序
3.3.5 核酸适配体的亲和性试验
3.3.6 核酸适配体的特异性试验
3.4 结果与讨论
3.4.1 AK偶联磁珠的表征
3.4.2 磁珠-SELEX筛选条件优化
3.4.3 筛选轮数的确定
3.4.4 测序结果分析及二级结构预测
3.4.5 核酸适配体亲和力测定
3.4.6 核酸适配体特异性分析
3.5 小结
第4章 聚多巴胺-荧光适配体传感器在甲壳类精氨酸激酶检测中的应用
4.1 前言
4.2 仪器与试剂
4.2.1 实验仪器
4.2.2 材料与试剂
4.2.3 溶液配制
4.3 实验方法
4.3.1 聚多巴胺的合成及表征
4.3.2 聚多巴胺探针的合成
4.3.3 方法学考察
4.3.4 样品预处理
4.3.5 实际样品的检测
4.4 结果与讨论
4.4.1 聚多巴胺的合成及理化性质表征
4.4.2 聚多巴胺探针的构建与优化
4.4.3 生物传感器的构建表征及方法学考察
4.4.5 实际样品的蛋白分析及精氨酸激酶的检测
4.5 小结
第5章 结论与展望
5.1 总结
5.2 创新点
5.3 展望
参考文献
致谢
本文编号：3724676
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