代谢工程改造枯草芽孢杆菌产乳酰-N-新四糖
发布时间：2023-11-09 18:54
乳酰-N-新四糖(Lacto-N-neotetraose,LNnT)是人乳寡糖中重要的成分之一,具有增强人体免疫力,调节肠道菌群和促进细胞成熟等重要的生物学功能。已被欧洲食品安全局(EFSA)、欧盟(EU)和美国食品药品管理局(FDA)批准可以作为营养强化剂添加到婴幼儿配方食品中。目前,LNnT的商业化生产主要包括化学合成和生物合成两种方法,其中生物合成法仅需以廉价的碳源和细胞内可再生供体为原料,且以较低的环境代价获得高经济产出,因此具有更为广阔的应用前景。LNnT(Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc)是由D-半乳糖、N-乙酰氨基葡萄糖、D-半乳糖和D-葡萄糖依次连接组成的线性四糖,其合成途径较为复杂。目前生物合成法仍存在一些不足限制了产物的高效合成,如胞内的合成前体供给不足、合成途径与竞争途径之间代谢流不平衡、代谢压力过大可能影响菌株的遗传稳定性等。本论文以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis,B.subtilis)为研究对象,通过引入外源基因构建LNnT的合成途径;利用模块化工程优化前体合成途径,强化和平衡胞内前体的供给;进一步通过构建CRISPRi...
【文章页数】：105 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略词注释表
第一章 绪论
1.1 乳酰-N-新四糖概述
1.1.1 乳酰-N-新四糖的性质
1.1.2 乳酰-N-新四糖的功能和应用
1.1.3 乳酰-N-新四糖及其衍生物的生产
1.2 枯草芽孢杆菌概述
1.2.1 枯草芽孢杆菌的特性及应用
1.2.2 B.subtilis发酵合成乳酰-N-新四糖分析
1.3 代谢工程策略概述
1.3.1 模块化工程
1.3.2 CRISPRi技术
1.3.3 启动子工程
1.4 本论文主要研究内容
1.4.1 立题依据和研究意义
1.4.2 本论文主要研究内容
第二章 枯草芽孢杆菌中LNnT异源合成途径的构建
2.1 前言
2.2 实验材料与方法
2.2.1 菌株、质粒和化学试剂
2.2.2 构建异源基因lgtA,lgtB游离表达质粒
2.2.3 整合表达异源基因lgtA,lgtB及 lacY
2.2.4 敲除β-半乳糖苷酶基因yesZ
2.2.5 过表达核苷二磷酸激酶基因ndk
2.2.6 摇瓶发酵
2.2.7 分析方法
2.3 结果
2.3.1 LNnT从头合成途径在B.subtilis中的构建
2.3.2 过表达lacY基因,敲除yesZ基因对LNnT合成的影响
2.3.3 优化关键基因lgtA和 lgtB对 LNnT产量的影响
2.3.4 强化ndk基因对LNnT合成的影响
2.4 讨论
2.5 本章小结
第三章 模块途径工程优化LNnT合成代谢网络
3.1 前言
3.2 实验材料与方法
3.2.1 菌株、质粒和培养条件
3.2.2 前体UDP-GlcNAc合成途径关键酶验证
3.2.3 前体UDP-Gal合成途径关键酶验证
3.2.4 优化组装前体模块
3.2.5 3-L发酵罐条件
3.2.6 分析方法
3.3 结果
3.3.1 关键前体UDP-GlcNAc模块的关键酶验证
3.3.2 关键前体UDP-Gal模块的关键酶验证
3.3.3 两个前体模块的不同强度组装对LNnT合成的影响
3.3.4 3-L罐间歇补料发酵及连续补料发酵对LNnT合成的影响
3.4 讨论
3.5 本章小结
第四章 基于CRISPRi系统的动态调控策略提高乳酰-N-四糖的合成
4.1 前言
4.2 实验材料与方法
4.2.1 菌株和培养条件
4.2.2 sgRNA序列的设计
4.2.3 构建分别抑制pfkA,pyk,zwf和mnaA基因的sgRNA表达质粒
4.2.4 构建多重抑制pfkA,pyk,zwf基因sgRNAs表达质粒
4.2.5 分析方法
4.3 结果
4.3.1 利用CRISPRi系统抑制竞争途径中的单个基因对LNnT合成的影响
4.3.2 多基因的抑制对LNnT合成的影响
4.3.3 解除LNTII转化为LNnT过程中的限速步骤
4.3.4 不同诱导剂的添加时间和添加量对LNnT合成影响
4.3.5 重组枯草芽孢杆菌的3-L罐连续补料发酵对LNnT合成的影响
4.4 讨论
4.5 本章小结
第五章 基于启动子工程的无质粒和芽孢的LNnT合成菌株的构建
5.1 前言
5.2 实验材料与方法
5.2.1 菌株、质粒及培养条件
5.2.2 基因组30个位点表达框构建
5.2.3 枯草芽孢杆菌内源启动子质粒构建
5.2.4 流式细胞仪筛选突变启动子
5.2.5 基于启动子工程的合成LNnT无质粒工程菌的构建
5.2.6 Spo0A启动子的突变构建
5.2.7 分析方法
5.3 结果
5.3.1 基因组不同整合位点的筛选和验证
5.3.2 枯草芽孢杆菌高表达强度的短启动子文库的构建
5.3.3 合成LNnT无质粒枯草芽孢杆菌的构建
5.3.4 基于Spo0A启动子改造策略的无芽孢枯草芽孢杆菌的构建
5.4 讨论
5.5 本章小结
主要结论及展望
主要结论
展望
论文创新点
致谢
参考文献
附录 Ⅰ:作者在攻读博士学位期间相关成果清单
附录 Ⅱ:论文中所用异源基因的核酸序列
附录 Ⅲ:论文中所用的部分引物
本文编号：3861824
【文章页数】：105 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略词注释表
第一章 绪论
1.1 乳酰-N-新四糖概述
1.1.1 乳酰-N-新四糖的性质
1.1.2 乳酰-N-新四糖的功能和应用
1.1.3 乳酰-N-新四糖及其衍生物的生产
1.2 枯草芽孢杆菌概述
1.2.1 枯草芽孢杆菌的特性及应用
1.2.2 B.subtilis发酵合成乳酰-N-新四糖分析
1.3 代谢工程策略概述
1.3.1 模块化工程
1.3.2 CRISPRi技术
1.3.3 启动子工程
1.4 本论文主要研究内容
1.4.1 立题依据和研究意义
1.4.2 本论文主要研究内容
第二章 枯草芽孢杆菌中LNnT异源合成途径的构建
2.1 前言
2.2 实验材料与方法
2.2.1 菌株、质粒和化学试剂
2.2.2 构建异源基因lgtA,lgtB游离表达质粒
2.2.3 整合表达异源基因lgtA,lgtB及 lacY
2.2.4 敲除β-半乳糖苷酶基因yesZ
2.2.5 过表达核苷二磷酸激酶基因ndk
2.2.6 摇瓶发酵
2.2.7 分析方法
2.3 结果
2.3.1 LNnT从头合成途径在B.subtilis中的构建
2.3.2 过表达lacY基因,敲除yesZ基因对LNnT合成的影响
2.3.3 优化关键基因lgtA和 lgtB对 LNnT产量的影响
2.3.4 强化ndk基因对LNnT合成的影响
2.4 讨论
2.5 本章小结
第三章 模块途径工程优化LNnT合成代谢网络
3.1 前言
3.2 实验材料与方法
3.2.1 菌株、质粒和培养条件
3.2.2 前体UDP-GlcNAc合成途径关键酶验证
3.2.3 前体UDP-Gal合成途径关键酶验证
3.2.4 优化组装前体模块
3.2.5 3-L发酵罐条件
3.2.6 分析方法
3.3 结果
3.3.1 关键前体UDP-GlcNAc模块的关键酶验证
3.3.2 关键前体UDP-Gal模块的关键酶验证
3.3.3 两个前体模块的不同强度组装对LNnT合成的影响
3.3.4 3-L罐间歇补料发酵及连续补料发酵对LNnT合成的影响
3.4 讨论
3.5 本章小结
第四章 基于CRISPRi系统的动态调控策略提高乳酰-N-四糖的合成
4.1 前言
4.2 实验材料与方法
4.2.1 菌株和培养条件
4.2.2 sgRNA序列的设计
4.2.3 构建分别抑制pfkA,pyk,zwf和mnaA基因的sgRNA表达质粒
4.2.4 构建多重抑制pfkA,pyk,zwf基因sgRNAs表达质粒
4.2.5 分析方法
4.3 结果
4.3.1 利用CRISPRi系统抑制竞争途径中的单个基因对LNnT合成的影响
4.3.2 多基因的抑制对LNnT合成的影响
4.3.3 解除LNTII转化为LNnT过程中的限速步骤
4.3.4 不同诱导剂的添加时间和添加量对LNnT合成影响
4.3.5 重组枯草芽孢杆菌的3-L罐连续补料发酵对LNnT合成的影响
4.4 讨论
4.5 本章小结
第五章 基于启动子工程的无质粒和芽孢的LNnT合成菌株的构建
5.1 前言
5.2 实验材料与方法
5.2.1 菌株、质粒及培养条件
5.2.2 基因组30个位点表达框构建
5.2.3 枯草芽孢杆菌内源启动子质粒构建
5.2.4 流式细胞仪筛选突变启动子
5.2.5 基于启动子工程的合成LNnT无质粒工程菌的构建
5.2.6 Spo0A启动子的突变构建
5.2.7 分析方法
5.3 结果
5.3.1 基因组不同整合位点的筛选和验证
5.3.2 枯草芽孢杆菌高表达强度的短启动子文库的构建
5.3.3 合成LNnT无质粒枯草芽孢杆菌的构建
5.3.4 基于Spo0A启动子改造策略的无芽孢枯草芽孢杆菌的构建
5.4 讨论
5.5 本章小结
主要结论及展望
主要结论
展望
论文创新点
致谢
参考文献
附录 Ⅰ:作者在攻读博士学位期间相关成果清单
附录 Ⅱ:论文中所用异源基因的核酸序列
附录 Ⅲ:论文中所用的部分引物
本文编号：3861824
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/qgylw/3861824.html
