Activin A对小鼠早期胚胎干细胞系建立及分化的影响

发布时间：2020-03-30 05:15

【摘要】：小鼠多能性胚胎干细胞(mouse pluripotent embryonic stem cells,mESCs)和上胚层胚胎干细胞(epiblast stem cells,EpiSCs)分别是从囊胚内细胞团(inner cell mass,ICM)和上胚层(epiblast)分离获得。ESCs其多能性的维持依靠Mek1/2、GSK3通路抑制剂(2i)及白血病抑制因子(LIF);而EpiSCs是由激活素A(Activin A,Act A)、成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)支持。本实验室利用添加Act A和bFGF化学成分明确的培养基(不包括KSR和饲养层细胞)培养小鼠囊胚获得了一种新型胚胎干细胞系(AFSCs)。本研究首先探究单独的Act A和bFGF对小鼠早期胚胎建系及对AFSCs细胞系诱导的影响,其次,用骨形态发生蛋白4(bone morphogenetic protein4,BMP4),GSK3通路抑制剂(CHIR99021)和白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)分别替代AF培养基中的bFGF,形成AB,AC,AL三种培养基,培养AFSCs,使其诱导为一种具有早期特殊胚层特征并具有自我更新能力和多能性的细胞。1.类上胚层干细胞系的建立将小鼠受精后3.5天的囊胚(E3.5)分别放入AF(Act A+bFGF)、A(Act A)、2A(2×Act A)、4A(4×Act A)和2F(2×bFGF)五种培养液中培养,在AF、2A、4A中成功获得了AF/SCs(与AFSCs的建立来源及方法相同)、2A/SCs和4A/SCs三种类上胚层干细胞系,且建系效率分别为15%、14.3%和7.2%。4A/SCs形态上类似AF/SCs,2A/SCs呈现杂合状态,二者AP染色均有阳性细胞。与2A/SCs相比,4A/SCs中多能基因和分化基因都显著提高。2.Act A对AF/SCs细胞系的影响将建立的AF/SCs细胞系放在添加不同浓度的Act A和bFGF的6种培养液(Act A、2×Act A、4×Act A、bFGF、2×bFGF、4×bFGF)中培养,获得了6种细胞系,分别为AF-A/SCs、AF-2A/SCs、AF-4A/SCs、AF-F/SCs、AF-2F/SCs和AF-4F/SCs。AP染色结果显示添加Act A组的阳性细胞数要比添加bFGF组的细胞数多。另外AF-4A/SCs高表达Nanog、Gata4和Cdx2;但AF-4A/SCs嵌合结果显示在胚胎和胚外结构中没有标记细胞,不具备贡献到胎儿的能力。3.Act A和BMP4共同作用对AF/SCs细胞系的影响由BMP4、CHIR99021和LIF分别替代AF/SCs培养基中的bFGF,对AF/SCs进行诱导,诱导后的细胞系分别命名为AF-AB/SCs、AF-AC/SCs和AF-AL/SCs。AF-AB/SCs和AF-AL/SCs与AF/SCs克隆形态相似,AP都呈阳性。AF-AB/SCs和AF-AL/SCs中高表达Nanog、Gata6和T。通过嵌合体制备技术证明:当把AF-AB/SCs和AF-AL/SCs注射到8细胞胚胎,在体外培养44小时,发现两种细胞既贡献到ICM又贡献到滋养外胚层(trophectoderm,TE)。进一步进行体内移植实验结果证明AF-AB/SCs只贡献到E6.5的胚外组织,而AF-AL/SCs既不贡献到胚胎也不贡献到胚外组织。转录组分析结果显示:AF/SCs、AF-AB/SCs和AF-AL/SCs有不同的基因表达模式,AF-AB/SCs中发育调节基因上调,部分差异表达基因富集于胚胎外组织发育和多能性信号通路。综上所述,Act A具有单独支持和维持干细胞自我更新的能力。Act A和BMP4可以将AF/SCs转化为类中胚层干细胞。由于人的ESCs的培养条件也是依赖Act A和bFGF,这个研究为人的ESCs培养及分化提供了新的见解。
【图文】：

图 1.1 小鼠胚胎在 E0.5-E5.5 时期的形态变化和细胞谱系示意图.1 Schematic diagrams of morphological changes and cell lineage of mouse embryos du鼠多能干细胞研究进展个多能干细胞于1981年将小鼠囊胚培养在用丝裂霉素C处理过的STO成得[1,2]，被称为胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs），成纤维细胞饲白血病抑制因子（leukaemia inhibitory factor，LIF）。1982年，，另一团队雌生殖的小鼠进行研究分析，建立胚胎干细胞系并将其注入受体小鼠囊有嵌合能力并产生嵌合率很低的嵌合体[25]。1984年，通过把ESCs注入SCs形成包括生殖细胞中的所有组织的嵌合体[26]。1993年，Wood等人利培养的方法，提高了ESCs形成生殖系嵌合的能力，其中生殖系的嵌合嵌合概率是70%[27]。1996年，Peli研究团队得到了体细胞嵌合率为60%和的ESCs嵌合体[28]。ESCs对所有体细胞谱系和种系强烈兴奋的无限制潜

控制小鼠胚胎干细胞自我更新和分化的信号通路的示意图
【学位授予单位】：内蒙古大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q954.4

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本文编号：2607093