磷脂酶D的重组优化表达及生物转化制备磷脂酰丝氨酸

发布时间：2020-03-30 06:23

【摘要】：磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine;PS)作为大脑中的主要酸性磷脂,具有提高认知力、抗压抑等功效,可用于医药、食品等领域。由于自然界中含量较少,且提取困难,近年来,人们开始关注酶转化法制备PS。即通过磷脂酶D(phospholipase D;EC 3.1.4.4;PLD)催化底物磷脂酰胆碱和L-丝氨酸合成。目前虽然取得了一定研究成果,但仍存在一些不足之处:(1)野生菌PLD分泌量远低于工业生产标准;(2)现有研究中PS多采用有机相和水相两相催化体系生成。基于此,本研究以Bacillus subtilis WB600为宿主,研究了PLD的异源高效表达,并优化了PS在纯水相中的生成条件。主要研究结果如下:(1)PLD的异源表达及信号肽优化。将Streptomyces racemochromogenes来源的PLD基因按照枯草芽孢杆菌密码子优化性合成,并根据N端带电荷数和H端疏水性选择了7条来源于枯草芽孢杆菌的信号肽,将其融在PLD基因N端,将这7段融合片段克隆到表达质粒pSTOP并转入B.subtilis WB600中表达,比较了不同信号肽牵引下的PLD分泌效率。结果显示,PLD在B.subtilis WB600中成功实现胞外异源分泌表达,且在信号肽amyE介导下获得最高胞外酶活11.3 U×mL~(-1),是内源性信号肽介导下胞外酶活分泌量的5.27倍,ywbN信号肽介导的胞外PLD酶活最低(3.2 U×mL~(-1))。(2)表达载体优化。分别构建了3个重组表达质粒pSTOP-PLD-amyE-his、pMA0911-PLD-amyE-his和pP43-PLD-amyE-his,包含这3个质粒的重组菌分别命名为STT1、ST2和ST3。结果显示,ST2和ST3的PLD酶活高于STT1,ST2菌株获得最高酶活19.1 U×mL~(-1),比对照提高约69.03%,通过对3株菌的胞外上清液进行Western Blot检测,在约53 kDa处均可见明显单一条带,与报道条带大小相符。(3)RBS及spacer区优化。通过RBS Calculator v2.0软件对重组质粒pMA0911-PLD-amyE-his的RBS及spacer区进行优化,选择了翻译效率较原始序列分别提高3、6、9、12倍的四种组合,分别得到RS1、RS2、RS3和RS4这4株重组菌。结果显示RS1菌株获得最高胞外酶活24.2 U×mL~(-1),较对照提高约26.7%,而RS4菌株胞外酶活反而较对照降低约11.8%。我们发现随着RBS强度的增加,PLD胞外分泌量呈现先升高后降低的趋势,这表明RBS的翻译强度并不明显与PLD的分泌量呈正相关。(4)15 L发酵罐实验及酶学性质研究。15 L发酵罐实验,酶活提高约5倍,达到116.2U×mL~(-1)。对RS1菌株进行遗传稳定性实验,重组质粒经过5代后的保留率仍为100%。纯化RS1菌株的胞外上清液,测定PLD酶学性质。结果表明,PLD蛋白条带大小约为53 kDa,与已报道条带大小相符,最适反应温度45℃,最适反应pH 5.5,4℃下可长期保藏。(5)优化纯水相中生产PS工艺,避免了有机相的使用。最佳反应条件下:PC60:L-丝氨酸1:10(g×g~(-1))、酶添加量500 U、反应温度45℃、反应pH 5.5、反应时间6 h、氯化钙添加量10%。反应6 h后,以PC60为底物,PS转化率达到96.7%,PC剩余2.3%,副产物PA仅生成0.2%,底物向产物实现高效转化。
【图文】：

图 1-1 PLD 家族的基本结构图Fig. 1-1 Scheme of the basic structure of PLDs 和 Kerr 认为具有这四个保守基序的酶是上述 PLD 超家族成员[9]。在这分类是基于序列同源性提出的。第 I类包括来自真菌和高等真核生物的含。这些酶中有一些具有不同的 N 端序列，其中包括脂质或钙结合调控域 PLD 活性。第 II 类酶包括细菌 PLD，如链霉菌 PLD。第 III 类和第 IV 分成的酶、细菌心磷脂合成酶和磷脂酰丝氨酸合成酶。其余的分类则包含了的酶。第 V 类酶包括病毒 p37 和 K4。第 VII 类和第 VIII 类分别包括核内 D 结构家族成员如核酸内切酶、细菌酶（Nuc[11]、BfiI、链霉菌 PMF-PLD[12]、的蛋白晶体结构目前已被报道。从现有的结构可以明显看出，，PLD 超家存在保守折叠。

图 1-2 链霉菌 PMF-PLD 的三维蛋白结构Fig. 1-2 Tertiary structures of PMF-PLD磷酸二酯酶活性，可以参与两个反应[17]：（PA）。（2）催化磷脂酰胆碱与亲核供体（PE）、磷脂酰肌醇（PI）和 PS 等稀基上，咪唑氮对底物磷原子进行亲核攻团提供一个氢原子，形成一个五配位磷质子，从而使附近的水或其他醇分子脱成磷脂或者 PA。
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q78;Q55

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本文编号：2607175