海洋细菌中参与二甲基巯基丙酸内盐代谢产物丙烯酰辅酶A和二甲基硫代谢关键酶的结构与催化机制研究

发布时间：2020-04-05 14:20

【摘要】：二甲基巯基丙酸内盐(dimethylsulfo niopropionate,DMSP)是海洋中一种重要的有机硫化合物,是地球上含量最丰富的有机硫存在形式之一。全球海洋每年可产生大约109吨的DMSP。DMSP可以被微生物胞内的DMSP裂解酶裂解,生成二甲基硫(dimethylsulfide,DMS)和丙烯酸。DMS是一种挥发性的气态有机硫化合物,在全球硫循环中发挥着重要作用。它可以通过海气交换进入大气,是硫元素从海洋进入大气中的主要形式。此外,DMS还在云凝结核的形成中发挥着作用,能够影响云的形成。DMS在全球硫循环以及生态中有重要作用,因此其合成以及代谢方式受到了广泛的关注。DMSP在微生物体内被裂解时除了产生DMS,还会产生等摩尔量的丙烯酸。丙烯酸可以作为一种碳源被利用。丙烯酸的代谢产物为丙烯酰辅酶A,它对细胞是有毒性的,在胞内大量积累会对生物体生理生化状态产生严重影响,因此丙烯酰辅酶A的代谢过程也受到了广泛关注。在本论文中,我们利用生化分析以及X射线晶体学等手段,将DMSP的下游代谢产物丙烯酰辅酶A和DMS这两种物质代谢过程中的关键酶作为研究对象,对这些酶的结构、功能与催化机制进行了研究,为系统阐明海洋细菌代谢DMSP的过程与分子机制提供了重要依据。(1)丙烯酰辅酶A还原酶AcuI的结构与催化机制DMSP被海洋细菌转运进胞内后,在DMSP裂解酶作用下被裂解,生成DMS和丙烯酸,丙烯酸可作为碳源在胞内进一步被代谢。丙烯酸可以在丙酰辅酶A连接酶PrpE或者酰基辅酶A转移酶AcuN作用下,生成丙烯酰辅酶A。丙烯酰辅酶A对细菌细胞是有剧毒的,很低浓度的丙烯酰辅酶A就可以使细菌致死。因此,丙烯酰辅酶A不能在胞内积累,必须尽快被代谢掉。丙烯酰辅酶A可以被丙烯酰辅酶A还原酶AcuI代谢成丙酰辅酶A,或者被丙烯酰辅酶A水合酶AcuH代谢成3-羟基丙酰辅酶A,从而防止丙烯酰辅酶A的积累影响细胞的生理生化状态。本实验室前期已经对参与丙烯酸代谢的关键酶PrpE以及AcuN的结构和催化机制进行了研究。在此基础上,为了阐明海洋细菌代谢丙烯酰辅酶A的分子机制,本文对参与丙烯酰辅酶A代谢的两个关键酶丙烯酰辅酶A还原酶AcuI和丙烯酰辅酶A水合酶AcuH的结构和催化机制进行了研究。AcuI蛋白能将丙烯酰辅酶A还原成丙酰辅酶A,在丙烯酰辅酶A的代谢过程中发挥重要作用。我们以来自海洋玫瑰杆菌类群的模式菌株Ruegeria pomeroyi DSS-3的AcuI作为主要研究对象,对AcuI的晶体结构以及AcuI催化丙烯酰辅酶A生成丙酰辅酶A这一过程的分子机制进行了研究。我们对AcuI进行了异源表达与纯化,并对该蛋白进行了结晶与结构解析。我们分别解析了 AcuI[没有结合任何配体的结构(apo-AcuI)以及结合有还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)的结构(AcuI-NADPH)。每个AcuI的单体有两个结构域,一个是催化结构域,另一个是罗斯曼折叠结构域。突变体酶活检测结果表明,Arg323突变成丙氨酸之后,酶活力有明显的下降。将Arg323突变成大小类似并且带正电荷的赖氨酸后,酶活力基本没有发生变化;而突变成大小类似但不带电的异亮氨酸后,酶活力基本全部丧失。这些结果表明Arg323可能在催化过程中参与电子传递并且充当质子供体。基于结构分析以及突变验证,我们提出了 AcuI催化反应的分子机制。在该反应中,NADPH烟酰胺C4上的氢攻击丙烯酰辅酶A的C3并转移电子,进而形成烯醇中间体。烯醇中间体将电子传递给Arg323,最终形成产物丙酰辅酶A。另外,我们对Acud在海洋细菌中的分布进行了分析,发现含有PrpE蛋白的菌株大多数都含有AcuI,这暗示AcuI确实在丙烯酰辅酶A的代谢中发挥重要作用。本章研究对更好地了解丙烯酰辅酶A的代谢机制有重要意义。(2)丙烯酰辅酶A水合酶RdAcuH的结构与催化机制AcuH是一个丙烯酰辅酶A水合酶,能够催化丙烯酰辅酶A水合生成3-羟基丙酰辅酶A,在丙烯酰辅酶A的代谢过程中发挥重要作用。我们将来自菌株R.nubinhibens ISM的AcuH(RdAcuH)作为主要研究对象,对RdAcH的晶体结构以及其催化丙烯酰辅酶A水合反应的分子机制进行了研究。我们对RdAcuH进行了异源表达与纯化,并对该蛋白进行了结晶与结构解析。RdAcuH在不对称单位中以同源六聚体的形式存在。每个RdAcuH单体含有两个结构域,分别是氮端结构域与碳端结构域。RdAcuH的活性中心位于一个单体的氮端结构域和相邻单体的碳端结构域之间。我们对RdAcuH的结构与其同源结构进行比较,结果表明RdAcuH的整体结构与来自Rattus norvegicus的烯酰辅酶A水合酶ECH的结构十分类似。我们通过序列比对和结构叠加的方式,找到了RdAcuH中两个保守的氨基酸残基,Glu112和Glu132,并分别构建了 E112A和E132A突变体并对它们的酶活力进行检测。生化检测实验显示这两个突变体均丧失了酶活,表明这两个氨基酸残基在RdAcuH的催化反应中发挥着重要的作用。基于对RdAcuH结构及点突变实验的分析,我们提出了RdAcuH催化反应的分子机制。RdAcuH的Glu132攻击一个催化相关的水分子,这个水分子被激活,进而攻击丙烯酰辅酶A,形成一种中间态。之后,冗余的电子传回Glu132,水分子加到烯酰辅酶A上,从而生成了 3-羟基丙酰辅酶A。本章研究对更好地了解丙烯酰辅酶A的代谢机制有重要意义。RdAcuH除了催化丙烯酰辅酶A的水合反应外,还能催化DMSP去甲基化途径的下游代谢产物3-甲硫基丙烯酰辅酶A的水合反应。RdAcuH的同源蛋白在很多不能代谢DMSP的菌株中也有分布,这表明RdAcuH的催化机制或许能推广到其他代谢过程中去,有更广泛的意义。(3)DMS单加氧酶DmoA的结晶与结构分析DMS是一种挥发性的有机硫化物,它在全球硫循环中发挥着重要作用,DMS从海面扩散进入空气是硫元素从海洋进入到大气最主要的形式。空气中的DMS经过一系列过程,参与形成凝结核,能够影响云的形成。目前对DMS代谢的研究表明,生物降解是DMS最主要的降解方式。DmoA是一个DMS单加氧酶,能催化DMS代谢为甲硫醇的过程。我们把来自菌株Hyphom icrobium sulfonivorans 的DMS单加氧酶DmoA作为研究对象,对其进行了结晶并对其晶体结构进行了研究。我们对DmoA进行异源表达与纯化,并进行了 DmoA的结晶。在我们解析出的结构中,每个不对称单元中含有两个DmoA单体。DmoA结构由TIM桶(TIM-barrel)结构以及额外插入区域(additio nal ins ertion,AI)构成。DmoA的结构中有5个额外插入区域,分别是AI1、AI2、AI3、AI4以及AI5,它们均位于外侧的a螺旋和内侧的β折叠之间。这种额外插入区域在DmoA的同源结构,如长链烷烃单加氧酶LadA以及二苯并噻吩砜单加氧酶BdsA中也有发现。我们对DmoA、LadA以及BdsA三者的结构进行了叠加比较,发现它们的单体结构很相似。我们对这三个结构的底物结合口袋进行分析后发现,DmoA的底物结合口袋与LadA及BdsA的相比要更小。DmoA结构中较小的底物结合口袋与它较小的底物(DMS)是相一致的。底物结合口袋大小的变化主要是由这三个结构中AI5cα3以及AI3的不同所导致的。本章研究对DmoA晶体结构以及底物结合口袋进行了分析,为更好地了解DMS的微生物降解过程提供了重要信息。(4)甲硫醇甲基转移酶MddA的异源表达与酶学性质研究DMS是一种重要的气态有机硫,目前主流观点都认为DMS主要是通过海洋中DMSP的裂解产生的。然而有研究表明,在海洋、淡水以及陆地环境中,还存在着不依靠DMSP生成DMS的方式。在分离自南极海底沉积物的菌株Pseudomonas deceptionensis M1T中发现了利用甲硫醇生成DMS的途径,被称为甲硫醇依赖的DMS生成途径。MddA是该途径中的一个关键酶,能以甲硫醇为底物生成DMS。MddA是一个膜蛋白,其表达纯化以及生化性质还没有相关报道。我们对来自 P.deceptionensis M1T的甲基转移酶MddA进行了异源表达纯化和基本酶学性质分析。我们通过对表达载体以及表达菌株的筛选,确定了最优的MddA大肠杆菌表达体系,即采用pET-15b为表达载体以及Escherichia coli C43(DE3)为表达菌株。我们对去污剂进行了筛选,确定十二烷基-β-D-麦芽糖苷(n-Dodecyl-β-D-maltopyrano side,DDM)为最合适的去污剂。经过条件优化之后,最终纯化出纯度较高、性质稳定的MddA蛋白,从而建立了MddA 的表达纯化体系。随后我们分析了MddA 的酶学性质。在DDM作去污剂的条件下,ddA催化反应的最适pH为8.0,最适温度为40℃。这些结果为进一步研究MddA晶体结构及其催化机制奠定了重要的前期基础。论文从DMSP下游代谢产物的代谢过程出发,对在丙烯酰辅酶A代谢过程中关键酶AcuI和和dAcuH的结构和催化机制、DMS代谢过程中关键酶DmoA的结构以及DMS合成过程中关键酶MddA的酶学性质进行了研究。研究结果对DMSP的下游代谢过程进行了补充和完善,为更好地了解DMSP的代谢过程提了重要信息。
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Ｄｕｙｌ邋ｅｔ邋ａｌ．邋１９９８）。ＤＭＳＰ于１９４８年在多管藻属Ｐｏ如如ｏ？／ａ／ａ劝扣／／ａ中被鉴定逡逑出来（Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｒ邋ａｎｄ邋Ｓｉｍｐｓｏｎ邋１９４８）。ＤＭＳＰ是一种两性离子，同时含有一个正逡逑电荷和一个负电荷（

阳车Ｓ射强度之间有很强的相关性（Ｖａｌｌｉｎａ邋ａｎｄ邋Ｓｉｍｏ邋２００７），能从侧面支持这一假逡逑说。然而ＣＬＡＷ假说缺少直接证据，有学者对其提出质疑，认为云凝结核的来逡逑源很复杂，并非仅有ＤＭＳ—种（图１－３）；同时ＤＭＳ浓度要最终影响到阳光反逡逑射率和海水温度，需要云凝结核浓度发生巨大的变化，这种看似合理的假说实际逡逑上很难真正发生（Ｑｕｉｎｎ邋ａｎｄ邋Ｂａｔｅｓ邋２０１１）。但无可否认的是，ＤＭＳ在大气中气溶逡逑胶以及云凝结核的形成中确实发挥着一定的作用（Ｂｒｏｏｋｓ邋ａｎｄ邋Ｔｈｏｒｎｔｏｎ邋２０１８；逡逑ＤｅｃｅｓａｒｉｅｔａＬ２０１１），，ＤＭＳ确实能够影响云的形成。而由于影响全球气候的条件逡逑十分复杂，ＤＭＳ对全球的气候能有多大程度上的影响，目前还有争议。逡逑Ｌｏｎｇ－ｒａｎｇｅ邋ｔｒａｎｓｐｏｒｔ逡逑ｉｎ邋ｔｈｅ邋ｆｒｅｅ邋ｔｒｏｐｏｓｐｈｅｒｅ逡逑Ｉ逦Ｃｌｏｕｄ邋ｄｒｏｐｌｅｔｓ逡逑ｈ２ｓｏ４邋—？邋ｓｏ４逡逑ｔ逦－逡逑Ｐａｒｔｉｃｌｅ邋ｇｒｏｗｔｈ：邋ｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ，逡逑ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ，邋ｃｌｏｕｄ邋ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ逡逑Ｅｎｔｒａｉｎｍｅｎｔ邋ｒａｔｅ逡逑｜逦Ｃｔｏｕｄ邋ｃｏｎｄｅ门ｓａｔｉｏｎ邋ｎｕｃｌｅｉ逡逑＾逦Ｓｅａ邋ｓａｌｔ逡逑Ｏｒｇａｎｉｃｓ逡逑Ｄｉｍｅｔｈｙｌ邋ｓｕｌｐｈｉｄｅ逡逑Ｗｉｎｄ邋ｓｐｅｅｄ．逦Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ邋ａｃｔｉｖｉｔｙ．逡逑Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ邋ａｃｔｉｖｉｔｙ．逦ｂｕｂｂｌｅ邋ｂｕｒｓｔｉｎｇ逦．逡逑ｗｉｎｄ邋ｓｐｅｅｄ逦．逦ｂｕｂｂｌｅ邋ｂｕｒｓｔｉｎｇ逡逑
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q936


本文编号：2615127