柑橘CitERF108转录子的克隆及抗旱功能研究

发布时间：2020-04-04 21:21

【摘要】：柑橘是我国重要的水果类作物,经济价值高,种植面积大。由于我国柑橘主要种植在丘陵山区,因此常面临干旱胁迫,影响其产量和品质。为抵御逆境胁迫,植物进化出大量抗逆相关基因,其中转录因子尤为重要,如:NAC、ERF、CAMTA、MYB、MYC、bZIP等。ERF是植物特有的一类转录因子,广泛参与生长发育和抗逆胁迫,近年来在拟南芥、水稻和番茄等模式植物上关于ERF抗逆性研究较多,但在柑橘中却很少报道。可见,解析柑橘ERF成员在抗逆中的生物功能,对改良柑橘抗逆性具有重要理论意义。本试验从资阳香橙(Citrus junoscv.“Ziyang”)中克隆获得CitERF108基因及其启动子(Q108)序列。利用生物信息学对CitERF108的基因结构、亲缘关系、预测蛋白特性等进行了分析,同时对Q108上的顺式作用元件进行了预测。采用基因表达、亚细胞定位和遗传转化等手段,研究了CitERF108在抵抗干旱胁迫中的生物功能和响应机制。主要结果如下:(1)从资阳香橙中克隆获取柑橘CitERF108(ID:Ciclev10001138)全长,运用生物信息学对其预测蛋白分子量、等电点、不稳定系数、结构域等分析,结果表明该基因含1个内含子,可编码448个氨基酸。CitERF108属于亲水蛋白,含有ERF家族特有的AP2保守结构域,且AP2保守结构域内第14和第19位分别是丙氨酸和天冬氨酸,含有WLG、YRG、RAYD保守元件;聚类分析发现,CitERF108与拟南芥AtERF111亲缘关系较近,推测柑橘CitERF108可能参与了ABA依赖型应激反应,并能增强植株的抗旱、抗盐性;亚细胞定位表明:CitERF108位于细胞核中。(2)基因表达分析结果表明,CitERF108在根、叶、子叶、果皮和种子中均有表达,其中在种子中表达量最高,而在茎中几乎不表达;激素和非生物胁迫处理结果表明,在根中该基因受SA、ETH、6-BA、IAA、ABA、JA、GA_3以及非生物胁迫干旱和盐害的诱导;在叶中受ETH、JA诱导,而在SA处理条件下是呈现先上升再下降又上升的趋势,其中3h时表达量最高,6h、12h表达量急剧下降,24h时又上调;在6-BA、ABA、GA_3条件下是先上调后下调的表达模式,都是在24h时表达量下降,其中,在6-BA和ABA处理条件下都是在6h时达到峰值,GA_3处理条件下是在3h时达到最高点;在IAA处理条件下呈现出先下降后上升的趋势,在3h时表达量下降,6h时又开始逐步上升,在盐害处理条件下,3h、6h、12h时上调趋势不明显,24h时骤然上调达到最高点,在干旱处理条件下,3h时略有下降,6h时有所上升,12h达到峰值,上述结果表明,CitERF108在柑橘的生长发育和逆境响应中发挥着重要作用。(3)将CitERF108转化烟草,获得T0代转基因植株。转基因植株较野生型表现出更强的抗旱性。在干旱处理后,转基因株系叶片中脯氨酸含量高于野生型,其中,野生型株系脯氨酸含量为109.5μg,而转基因的三个株系达到117.3μg、221.5μg和112.3μg;在转基因株系中NtSOD和NtCAT的表达量明显高于野生型,表明CitERF108调控了抗旱相关基因的表达;台盼蓝染色结果表明,干旱处理后的转基因植株叶片显色较野生型浅,表明野生型株系细胞膜的完整性较转基因差。上述结果表明,CitERF108主要通过提高转基因植株的脯氨酸含量和抗氧化能力来抵御干旱逆境。(4)对启动子顺式作用元件预测发现,Q108启动子序列中含有响应水杨酸、生长素、茉莉酸、脱落酸、乙烯以及温度和光等顺式作用元件;构建携带GUS基因的Q108表达载体,并转化烟草,通过GUS组织化学染色显示,6mmol/L的ACC溶液处理24h后,叶脉部位被染成蓝色,但蓝色较深的部位在叶缘;1mmol/L的ABA溶液处理24h后,叶脉部位被染成蓝色,且染色较为均匀;4℃冷害处理3h后,叶脉部位被染成蓝色;20%PEG6000处理24h后染色部位均在烟草腺体顶端,而无处理及对照处理均未被染成蓝色。
【图文】：

序列,途径,转录因子,家族

图 1-1 植物响应逆境的一般途径（Huang et al., 2012）-1 Generic pathway for plant response to stress（Huang et al., 2的生物活性受核定位、寡聚化、转译后的蛋白磷酸化化作用等的影响，且不同转录因子的序列和结构各异等, 2008;未丽, 2008），其主要功能是调控植物体的各 bZIP、NAC、 MYB、WRKY、 AP2/ERF 转录因子成、次生代谢、昼夜节律、生物及非生物胁迫、抗病广泛存在于动物、植物、微生物中，是一类较为保守006），，该家族转录因子中，超表达辣椒 CAbZIP1 基因化和花瓣数量减少（陈儒钢等, 2010）；玉米 ZmbZIP应 ABA 信号（Ying et al., 2012）；NAC 家族矮牵牛及形态建成，拟南芥 CUC2 基因影响顶端分生组织 Souer et al., 1996）；MYB 家族拟南芥 AtMYB23 基因主细胞分化过程（Matsui, 2005），AtMYB11，AtMYB1

柑橘,系统进化树,拟南芥,家族

图 1-2 柑橘和拟南芥 ERF 家族蛋白系统进化树Fig1-2 Phylogenetic tree based on protein sequences of ERF members from citrus andArabidopsis.3.3 ERF 的生物功能植物激素乙烯广泛参与植物种子萌发、细胞伸长和凋亡、果实成熟、使瓜植物雌花增加、器官的脱落及衰老等生长发育过程。ERF 转录因子是乙烯信导途径最末端的信号转导元件（Ohmetakagi et al., 1995;张改云, 2008;王中凤004），研究表明，该家族转录因子主要够通过结合启动子上相应的顺式作用元节相关目标基因表达，进而参与植物胁迫应答（图 1-3），如：ERF 亚家族P2 结合域能够特异性识别 GCC-box（AGCCGCC）和 CRT/DRE（C/GCCGA类顺式作用元件，这两类顺式作用元件普遍存在于与抗性相关基因的启动子：拟南芥 AtERF2、番茄 TERF2/LeERF2、JERF1、JERF3 等（庄静等, 2016; Ht al., 2009; Zhang et al., 2010; 陈林波, 2010; Wang et al., 2004; Zhang et al., 200
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q943.2;S666

【参考文献】