竹林毛栓菌的诱变选育及其产酶条件优化

发布时间：2020-04-07 22:18

【摘要】：漆酶是木质素降解酶系的主要降解酶,是一种胞外酶。它能催化苯环开环,降解芬酸类物质,能在一定程度上缓解竹林地的土壤酸化。通过前期的筛选工作,已从竹林中筛选出高产漆酶的毛栓菌27-1,该菌株的漆酶酶活力达到75.45 U,其酶活远高于已报道的同类菌株,该菌株对于竹木质素有良好的降解能力。因此通过对此菌株进行诱变选育的手段,从而获得稳定高产的菌株,最终提高漆酶产量,提升该菌株对木质素的降解能力。(1)选用紫外照射与亚硝基胍复合诱变方法对毛栓菌27-1进行诱变选育。观察突变菌株的平板表现进行菌株的初筛,对初筛后的菌株进行漆酶酶活的复筛,得到稳定高产的突变菌株。在愈创木酚平板初筛过程中,根据平板变色的程度和变色圈直径,共筛选出10株平板表现良好的菌株。酶活复筛后,发现其中8株菌株产生正向突变,且对其中3株酶活较高的菌落进行遗传稳定性研究。最终得到突变菌株ZB-563,该菌株的漆酶酶活力达到了95.15 U,相较于出发菌株提高了21.26%,是一株高产漆酶的稳定菌株。(2)通过改变菌株培养时间、温度、转速、接种量和装液量这些液体发酵时的单因素,探索菌株的最优培养条件。结果表明,在装液量为150 mL的250 mL的三角瓶中接种12.5%的种子液,于30℃下,200 r·min~(-1)震荡培养可实现最优情况。(3)通过对培养基的成分进行响应面分析,确定了菌株的最适液体发酵液组成为葡萄糖13.69 g·L~(-1),硫酸铜0.5 g·L~(-1),pH为4.33,蛋白胨10 g·L~(-1),硫酸锰0.4g·L~(-1),磷酸二氢钾2 g·L~(-1),硫酸镁0.5 g·L~(-1),硝酸钙1 g·L~(-1),Tween80 2 g·L~(-1)。在最适条件下突变菌株在培育容器中的酶活达到129.68 U,较出发菌株提高了71.87%。(4)对ZB-563的实际降解能力探究结果表明,与出发菌株相比,突变菌株ZB-563能显著提高基质的失重率和木质素降解率。进一步说明突变菌株拥有比出发菌株更好的降解能力,能更好的降解竹木质素。在降解竹叶方面,菌株ZB-563在40天内的累计降解率为30.93%,高于黄孢原毛平革菌的降解效率。将培养出大量的菌株重新投放到原来的竹林地中帮助修复土壤中的微生物群落,又因其经过诱变选育,产酶能力强,能提高林地有机物的降解效率,对林地退化有减缓作用。该菌株还可以为嫩竹,笋壳等转变为青储饲料;降解木质素提高饲料的适口性,提升饲料品质提供帮助。亦可在处理竹材加工过程中,降解其产生的蒸煮废水里大量的木质素,提高污水处理效率。
【图文】：

生长曲线,生长曲线,菌株,紫外照射

图 2.1 菌株 27-1 的生长曲线Figure 2.1 Growth curve of strain 27-1 紫外-NTG 复合诱变条件确立用功率为 15 W 的紫外照射灯，照射距离为 30 cm，将照射不同时间的稀释涂布于 PDA 平板上，30℃避光培养，，计算菌落数，得出不同照射率。结果如图 2.2 所示，从图 2.2 中可以看出，随着照射时间的延长，死率不断提高，但是初期致死率不高，未达到实验要求，这是因为真菌对于紫外线有一定的耐受力。在照射时间达到 150s 时，致死率达到 88.外诱变的照射条件设置为 15 W 的紫外照射灯，照射距离为 30 cm，照0 s。

浸泡时间,死亡率,菌株,致死率

图 2.2 不同照射时间对菌株死亡率的影响Figure 2.2 Effect of Different Irradiation Time on Mortality of Strain 0.4mg·mL-1的 NTG 溶液浸泡不同时间后的离心沉淀进行梯度稀释，得到 NTG 溶液的处理时间。结果如图 2.3 所示，短时间的浸泡着浸泡时间的提高，菌株的致死率提高较快，当浸泡时间达到 50死率为 76.12%。若再增加浸泡时间，菌株的致死率将高于 90%，获得。因此 NTG 诱变的条件设置为 0.4 mg·mL-1的 NTG 溶液浸泡
【学位授予单位】：浙江农林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q933

【参考文献】