白氏文昌鱼TAK1基因的进化及免疫功能研究

发布时间：2020-04-08 21:10

【摘要】：丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)是细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。MAPKs信号转导通路存在于大多数细胞内,在将细胞外刺激信号转导至细胞及其核内,并引起细胞生物学反应,如细胞增殖、分化、转化及凋亡等的过程中具有至关重要的作用。TAK1(Transforming growth factor-βactivated kinase-1),又名MAP3K7,作为丝裂源激活蛋白激酶激酶激酶(MAP3K)家族的一员,是MAP3K家族唯一需要接头蛋白TAB1、2、3的帮助,从而起到激活作用的激酶,能够通过激活NF-KB、JNK及p38等通路,来参与免疫应答反应。文昌鱼作为从无脊椎动物进化到脊椎动物过渡类型的典型代表,成为整个生物进化史上一个不可缺少的“桥梁”,被誉为“活化石”。文昌鱼具有复杂的先天免疫系统,同时已有适应性免疫的雏形,对揭示脊椎动物免疫的起源具有重要意义。本论文以白氏文昌鱼TAK1为研究对象,对TAK1基因进行克隆,利用生物信息学方法对其结构及系统发生关系等进行分析,同时采用qPCR、CoIP等方法进一步分析TAK1基因的生物学功能,得到以下实验结果:(1)利用RT-PCR、RACE及End-to-End实验技术扩增获得白氏文昌鱼TAK1基因全长序列。TAK1基因全长为3527bp,其中TAK1-ORF序列长度为1905bp,编码634个氨基酸。(2)生物信息分析的结果表明:序列比对及相似性分析显示白氏文昌鱼TAK1蛋白序列与其它物种的同源蛋白序列具有较高的相似性;基因结构分析显示文昌鱼TAK1基因的编码区由18个外显子和17个内含子组成;保守结构域分析显示白氏文昌鱼TAK1基因包含一个保守的STKc结构域;系统发生树分析结果表明,白氏文昌鱼TAK1位于无脊椎动物和脊椎动物之间,与经典的物种进化地位一致;进一步的三维结构分析显示文昌鱼与人类的TAK1蛋白在三维结构上具有较高的相似性。(3)对文昌鱼TAK1基因的组织表达模式分析显示,TAK1基因在所检测的组织,包括性腺、鳃、肝盲囊、肠、肌肉及脊索中均有表达,其中在脊索和性腺中表达水平相对较高,而在肌肉和肠中的表达量相对较低。对LPS刺激白氏文昌鱼后不同时间点(2h,4h,6h,8h,12h,24h和48h)TAK1基因的表达量分析结果显示在文昌鱼用LPS刺激2h,12h后TAK1基因的表达量存在显著上调,在刺激24h后TAK1基因的表达量逐渐降低。(4)利用DNA重组技术构建了P3X-FLAG-TAK1表达载体,通过真核表达实验,成功表达出大小为68KDa的特异性蛋白,进一步利用Anti-FLAG tag抗体采用Western blot方法初步验证该特异蛋白为重组表达的TAK1蛋白。为了进一步探索文昌鱼中TAK1蛋白是否与高等物种中一致通过与TAB1互作来发挥功能,我们共转染了P3X-FLAG-TAK1和PCDNA3.1-Myc-TAB1重组质粒表达载体,通过CoIP分析结果显示,文昌鱼的TAK1蛋白与TAB1蛋白之间存在互作关系。
【图文】：

图 1.1 文昌鱼解剖图Figture 1.1 Dissection of amphioxus生活习性对水环境要求较高，，基本常年栖息在含有洁净水质的沙滩砾，有利于文昌鱼把绝大部分身体钻入沙子里，基本只把出砂砾外，因文昌鱼身体两侧不对称，因此一般左侧贴卧

TAK1信号通路[47]
【学位授予单位】：南京师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q953

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本文编号：2619833