褪黑素在盐胁迫条件下对莱茵衣藻和莜麦抗氧化能力的影响

发布时间：2020-04-08 22:30

【摘要】：褪黑素(N-乙酰基-甲氧基色胺,melatonin,MT)在动物体内中具有抗氧化作用,植物体内可能有类似功能。作为一种多效信号分子,MT能增强植物对各种生物和非生物胁迫的耐受性,在植物生长、发育和环境胁迫中具有重要作用。研究资料显示MT诱导植物抗氧化酶活性,增强植物的抗逆性能,在绿藻中同样表现着良好的盐胁迫防御特性,但是MT抗氧化保护作用的机制还有很多未知。“绿色酵母”莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)是一种单细胞绿藻,生长速度快,分子遗传学背景简单,常被当做模式微藻用于植物功能基因及次生代谢产物等研究。禾本科燕麦属植物莜麦又称裸燕麦(Avena nuda L.),是我国高寒山区特有的优质杂粮之一,具有独特的营养价值和保健功能,但是其生长受到非生物胁迫限制,制约其利用和发展。二者的研究中,有关MT功能资料还很匮乏,盐胁迫条件下单细胞藻类和高等植物莜麦中的MT功能研究薄弱。本研究分别以莱茵衣藻和莜麦为实验材料,探讨MT在植物中的抗氧化功能。具体包含两部分内容:一部分是借助微藻基因工程的反义RNA技术,玻璃珠法转化莱茵衣藻CC-503,获得MT合酶基因AANAT沉默的转基因莱茵衣藻,进而探讨盐胁迫下莱茵衣藻生长及抗氧化变化;另一部分关注外源施加MT条件下,高等植物莜麦的盐胁迫响应。通过本论文探讨盐胁迫中MT对植物生长的保护力,为植物中MT的功能研究提供参考,推动MT在藻类及植物中的功能研究。主要研究内容如下:(1)构建了含目的基因aanat的莱茵衣藻核反义表达载体pDBle-aanat:将已获得的含有目的片段aanat的克隆载体pMD18-aanat双酶切并纯化回收目的片段,然后用T4-DNA连接酶将aanat基因片段反向连接到pDBle载体上,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。经PCR、双酶切和测序进行鉴定目的菌株的鉴定,结果表明表达载体构建正确。(2)莱茵衣藻的遗传转化及筛选鉴定,获得转化藻株:莱茵衣藻的遗传转化及筛选鉴定,转化藻株经过博来霉素(Ble)抗性筛选培养后,再提取转化衣藻的DNA和RNA,分别进行ble基因PCR检测及AANAT基因表达水平qRT-PCR的检测等方法,最终获得了阳性藻株ARn(n为不同转基因藻系),并证明了aanat基因成功整合进了衣藻核基因组中并下调了AANAT基因的表达。(3)转基因藻株的生长情况:分别测定野生型藻(WT)和ARn藻系的OD值,连续7 d数据统计显示,ARn系的生长曲线趋势与WT藻系基本相一致,没有受到外源aanat基因整合的影响,只是转基因藻细胞密度较低。但是测定的不同ARn藻系中MT的含量平均为10.37 pg/mL,低于野生藻(MT含量为11.86 pg/mL),证实莱茵衣藻核基因组中AANAT基因沉默降低了MT的合成。(4)aanat基因沉默微藻(内源MT)在盐胁迫处理中的生理响应:(1)测定了不同藻株细胞内MT浓度,发现转化藻株AR_3中MT浓度均显著(p0.05)地低于未转化藻株,说明AANAT基因沉默藻株AR_3在盐胁迫后MT含量降低;(2)在50 mM和100 mM NaCl胁迫环境中,与WT衣藻相比,AR_3藻株中清除活性氧(ROS)和丙二醛(MDA)的能力较弱一些;抗氧化物酶活性和基因的表达情况均降低/下调。此结果说明了AR_3清除ROS和恢复细胞损伤的能力减弱。(5)外源MT对莜麦盐胁迫下的防护作用:(1)在150 mM NaCl盐胁迫下,外施不同浓度MT处理后,莜麦的株高、茎粗、鲜重、干重、叶绿素含量、叶面积和叶体积均增加;而叶绿素合成酶基因(ChlG)的表达量平均提高了6.40倍。这些结果说明MT有利于植物生长;(2)在150 mM NaCl盐胁迫下,外施不同浓度MT处理后,莜麦幼苗叶片过氧化氢(H_2O_2)、超氧阴离子(O_2~(·-))和MDA含量减少;超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)的活性均提高。该结果显示出MT可以提高植物抗氧化能力,可能是通过清除细胞ROS和增加抗氧化物酶的活性来实现这一功能;(3)150 mM NaCl盐胁迫下,外施不同浓度MT处理后,渗透调节物质脯氨酸的含量均增加;而细胞内可溶性蛋白含量则降低;细胞内脂质过氧化物酶基因(LOX和POX)表达量均上调。这些结果证实了在莜麦中脯氨酸可能是主要的渗透调节物质,同时也证实了MT可以诱导细胞抗盐性相关基因的表达,进而提高植物对盐胁迫的耐受性;(4)在150 mM NaCl盐胁迫下,外施不同浓度MT处理后促分裂原活化白激酶(MAPK)级联途径中的MAPK蛋白激酶(Asmap1和Aspk11)基因表达量均上调以及转录因子(TFs)NAC、WRKY1、WRKY3和MYB的表达量也均上调。这些结果揭示了MT在盐胁迫缓解中的重要作用,推测MT可能有类似与油菜素内酯(BRs)的作用,即通过介导MAPK介导H_2O_2信号通路,促进抗盐胁迫相关基因表达,进而提高莜麦对盐胁迫的耐受性。不管是MT合酶基因AANAT的低表达实验,还是外施MT实验均证实了MT的确具有抗氧化的功能。
【图文】：

生物合成途径,植物,羽扇豆,根茎

图 1 MT 在植物和动物中的生物合成途径[43]e 1 Biosynthetic pathway of MT in plants and in animals[4长发育的调控作用早被关注的是其可以作为生长调节剂对植物的生长在黄化的羽扇豆中已经得到证实[44]。与生长素（I可促进下胚轴的生长，较高浓度则具有抑制作用。内浓度梯度分布，推测与下胚轴的不同生长潜力有关。物中也有被证实[8]。外源性 MT 促进不同植物组织生的行为[45]，在红甘蓝[46]和芥菜[47]中 MT 具有促进/抑 MT 之间的关系还未得到证实，但它似乎可以并行A 的促进根茎生成的功能，MT 能够从羽扇豆中的周根或侧根[48]。这种根茎效应已在其他物种中也有研。另外在体外应用中，MT 作为细胞保护剂（抗氧化

应激反应,外源,细胞内

胞对应激的反应主要由细胞外物质与质膜蛋白的相互作用引发，这意味着植上存在应激的受体。细胞膜受体将应激信号转导到下游，引发产生包括 C 的第二信使，已经鉴定出许多转录因子（TFs），可以被 MT 上调[64]，MT 录物中也有与氧化还原稳态相关的基因，这些基因与生物和/或非生物胁迫。MT 也调节与特定应激相关基因的表达。例如，，MT 通过下调叶绿素酶（CLH表达[63]维持叶绿素含量，MT 也可通过下调了 PAO 基因的表达减缓苹果叶55]。高盐胁迫过程由于渗透势的变化会产生离子毒性[11]。NHX1 和 AKT1 是基因有助于维持离子稳态。植物叶片中 NHX1 和 AKT1 基因表达的上调，有植物的耐盐性[74]。此外，MT 可上调 C 重复结合因子（CBFs）/干旱反应元子（DREBs）的表达，进而激活 CAMTA1 和 ROS 相关的抗氧化基因 ZAT12 的转录激活，减少冷胁迫对植物的伤害[99]。MT 在调节多种基因的表达中作用，反映其在植物中的多效生理作用[63]。据记载，MT 还可通过直接猝灭响有毒金属的螯合作用进而提高植物对金属离子胁迫的耐受性[75]。
【学位授予单位】：西北大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q945

【参考文献】