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灵长类动物大脑相关基因调控区加速进化的DNaseⅠ超敏感位点的功能性研究与验证

发布时间:2020-04-10 15:15
【摘要】:人类与非人类灵长类动物之间大脑的不同之处在很大程度上是未知的,尤其是大脑功能差异,包括人类特有的社会和认知行为以及一些精神障碍。但是,导致这些差异背后的基因组水平上复杂驱动因素仍不清楚。通过与非人类灵长类动物基因序列比较,揭示基因水平的差异与表型变异之间的联系,是大脑进化遗传学研究的主要目标。已有假设认为大量非编码区域的调控元件的变异是导致人类与其亲缘关系较近的其他灵长类之间表型的差异的关键因素之一。因此,对潜在的大脑相关基因调控区进行进化及其功能分析,有助于更好理解人类大脑在适应性进化中分子水平上的差异如何导致表型性状的差异,也是本课题的主要研究目的。基因组中的DNaseⅠ超敏感位点(DNase Ⅰ hypersensitive site,DHS)偶联多种活性调控元件,包括启动子,增强子,沉默子,绝缘子与基因座位控制区。目前成熟的DHS-seq技术实现了高通量的DHS数据产出,不断完善DHS图谱。其中ENCODE计划与人类表观基因组计划中已发布数百个不同细胞系,不同组织的DHS数据,被广泛地应用在调控区域的研究中。近年来,多项灵长类之间DHS进化研究证明了这些区域在基因调控中具有重要作用,并因此影响人类特有的性状。此外,本课题组在先前研究中结合DHS对免疫系统中的主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)及抗病毒家族——TRIM(Tripartite motif)家族成员的调控区域进行灵长类之间进化分析与功能分析,进一步证实了DHSs在灵长类动物适应性进化中的作用。在本研究中,我们利用生物信息学方法,结合DHS数据对灵长类大脑相关基因调控区域中的加速进化调控元件进行功能性分析,推测这些加速进化的DHSs在灵长类大脑进化过程中的作用与意义。并结合CRISPR/Cas9敲除技术,Western Blotting技术与qPCR(real-time quantitative PCR,实时荧光定量核酸扩增)技术对加速进化DHS进行功能性验证。其结果如下:(1)在本研究中,根据本课题组先前研究中分析鉴定得到的2397个大脑相关加速进化DHSs(brain related accelerated DHSs,brain-aceDHSs),通过基因组注释文件与基因组调控区注释数据,揭示了brain-aceDHSs在基因组上的分布特征:大部分brainaceDHSs富集在转录起始位点的上下游10kb内,并主要分布在内含子与基因间区中,仅有少数一部分定位在基因编码区与启动子中。其中75个brain aceDHS与启动子区域重叠,303个与增强子重叠,1121个与具有转录元件特征的区域重叠。(2)根据UCSC已发布的Hi-C数据库,鉴定出潜在受brain-aceDHSs调控的544个靶基因富集在细胞增殖与周期的通路上,与大脑与神经发育密切相关。除此之外,发现部分brain-aceDHSs靶基因与报道的唐氏综合症或大脑疾病的相关基因一致。重要的是,本研究根据已有的人类,黑猩猩与恒河猴大脑组织表达数据,发现部分靶基因(部分靶基因在数据集中不具有表达数据)在人类与非人灵长类间呈现出表达模式的差异。(3)通过多序列比对与转录因子结合位点数据库比对,表明brain-aceDHS中有61个潜在的人特异性转录因子结合位点,包括CTCF,FOXH1和FOXQ1。此外,基于GWAS SNP,Hi-C和大脑组织的eQTL SNP数据,定位到16个GWAS SNPs和82个eQTL SNPs位于brain-aceDHS中,其调控与大脑发育或其他人类疾病相关的基因。(4)为了证实这些brain-aceDHSs中调控元件的功能,本研究使用CRISPR/Cas9敲除技术,并结合western blotting技术与qPCR技术证实了敲除brain-aceDHS(chr12:131621602-131623539)后,其靶基因GPR133的表达显著下降,表明了这个brain-aceDHS的增强子功能。有研究表明GPR133基因与胶质母细胞瘤相关,故本研究进一步证明了brain-aceDHSs内的SNP与大脑疾病的关联。综上所述,本研究从大脑相关基因调控区的变异分析,对于更好地理解在适应性进化中人类大脑表型差异形成的遗传学基础提供了重要线索。
【图文】:

内含子,基因间区,大脑,编码区


华南理工大学硕士学位论文分布在内含子与基因间区(图 3-2)。与所有用于进化分析的大脑相关 DHS 相比,内含子的比例在 brain-aceDHSs 中显著提高(51.23%与 54.90%,P = 0.05); 基因间区的比例极显著下降(40.96%与 38.13%,p <2.2e-16); 同时外显子的比例也是极显著下降(1.87%与 0.92%,p=0.0008)。p 值使用皮尔逊的卡方检验进行计算。与总的大脑相关DHS 相比,brain-aceDHS 在非编码区显着富集,与非编码区比编码区更容易进化和获得新功能的结果一致。值得注意的是, brain-aceDHSs 中的内含子比例显著高于大脑相关DHSs,,而已有文献报道内含子能够通过多种途径影响基因的表达[4]。

转录起始位点


每个brain-aceDHS与最近转录起始位点(TSS)的距离
【学位授予单位】:华南理工大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:Q78

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本文编号:2622383

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