肝素酶Ⅰ在原核工程菌中异源可溶性表达及性质表征的研究

发布时间：2024-07-06 10:04

　　肝素酶来源于肝素黄杆菌,是一类能够特异性降解肝素和乙酰肝素的多糖裂解酶。目前研究发现,肝素酶在制备低分子量肝素、抑制肿瘤细胞增殖,清除血液中残留肝素等方面具有重要的生物学作用,受到越来越多人的关注。目前研究最多的是肝素酶Ⅰ,肝素酶Ⅰ在重组大肠杆菌中可溶性表达低,导致其产量较低,纯化较难,成本较高等问题,限制了其在医药方面的应用。因此寻找合适的方法来提高肝素酶Ⅰ的产量和纯度具有重要的意义。分子伴侣素CpkA是从嗜热菌Thermococcus kodakarensis中发现的耐热伴侣蛋白,具有辅助蛋白折叠功能和ATPase活性。本文构建重组质粒pACYC-CpkA和切去前导肽并加上带正电signal-tag的HepI’-28a质粒,并以单转或共转化形式转入大肠杆菌E.coli DE3(BL21)中诱导表达,通过镍柱纯化,除盐柱除盐,阳离子交换柱层析等优化纯化方式获得可溶性的HepI’蛋白;同时在E.coli DE3-RIPL中原核表达分子伴侣素CpkA,经85℃热处理1h、饱和度为80%的硫酸铵沉淀、透析除盐和阴离子交换柱层析,获得高纯度CpkA蛋白;利用本文制备的分子伴侣素CpkA蛋白在...

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【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图1.1肝素基本结构图

第一章绪论1第一章绪论1.1肝素19世纪初，人们发现在动物组织中含有能够抑制血液凝结的物质，1922年Howell最早将其从动物肝脏中提取分离出来，并正式将其命名为肝素（unfractionatedheparin，UFH）[1]。随着科学技术的进步与发展，肝素的结构逐渐被大家所了....

图1.2GroEL/ES的结构[46]

第一章绪论6端和赤道区，起传递信号的功能。GroES[48]因为对分子伴侣GroEL的复性功能有辅助作用，又被称为协同分子伴侣。已经有实验表明分子伴侣GroEL/ES在可以帮助底物蛋白在大肠杆菌中正确折叠[49,50]，在翻译中和翻译后起作用[51]。GroEL/ES通过静电作用....

图2.1HepI基因序列

第二章肝素酶I的原核表达8第二章肝素酶I的原核表达通过NCBI网站的GeneBank数据库和查询文献[33]，最终确定肝素酶I（HepI）的碱基序列，全长1155bp。利用NEBcutterV2.0对HepI的序列进行分析，并与pET-28a中多克隆位点区域进行比对，确定在基因5....

图2.2HepI-28a质粒的提取与PCR验证结果图

第二章肝素酶I的原核表达17图2.2HepI-28a质粒的提取与PCR验证结果图1:HepI-28a质粒;2和3:以HepI-28a为模板进行PCR扩增出的产物;M:DNAMarkerDL150002.3.2测序验证将初步筛选出来的质粒送到库美公司测序，利用NCBIBlast将测....

本文编号：4002436