地衣芽孢杆菌GH48家族外切纤维素酶CelA的异源表达和功能研究

发布时间：2020-04-19 02:37

【摘要】：近年来资源危机的加剧使得人们对生物能源的需求急剧增加,木质纤维素作为最丰富的生物质资源,其生物转化研究备受关注。纤维素酶特别是进行性外切纤维素酶被认为是生物转化酶系的重要组成部分,对转化速率具有重要影响。本研究对来源于地衣芽孢杆菌的GH48家族外切纤维素酶CelA进行了基因克隆和异源表达,并对该酶的酶学性质和相关功能残基进行了研究,还探讨了CBM结构域对CelA催化特性的影响。具体研究内容及结果如下:(1)外切纤维素酶CelA的基因克隆及异源表达对来源于地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis ATCC14580)的外切纤维素酶CelA进行了序列分析,结果显示该酶包含704个氨基酸,没有明显的信号肽和跨膜区,只有一个隶属于GH48家族的功能域。利用在线软件对CelA进行了同源建模,结果显示CelA具有GH48家族酶典型的(α/α)_6桶形折叠,进一步确定CelA为GH48家族纤维素酶。利用同源扩增的方法从Bacillus licheniformis ATCC14580基因组中克隆了celA基因,并转化至E.coli Rosetta(DE3)中进行了异源表达,利用亲和层析纯化出目的重组蛋白。(2)CelA催化特性的研究底物特异性测定结果显示CelA以再生无定形纤维素RAC为底物时酶活力最高,其最适反应pH值为9.0,最适反应温度为50℃,具有较好的温度和pH稳定性。Mn~(2+)和低浓度的Na~+、Fe~(2+)、Fe~(3+)对重组酶的酶活力有促进作用;K~+、Ca~(2+)、Mg~(2+)、Zn~(2+)、Cu~(2+)、Co~(2+)、Ni~(2+)对酶活有抑制作用。甲醇、乙醇、异丙醇、β-巯基乙醇、吐温-80、triton X-100、EDTA和高浓度的甘油使酶活力明显下降,PMSF、尿素和低浓度的甘油对酶活力没有显著影响。CelA水解纤维寡糖的最小底物为纤维四糖,水解产物为二糖分子,水解纤维五糖的产物为二糖和三糖,是一种纤维二糖水解酶。(3)CelA功能位点的研究根据序列及结构分析结果,确定了可能与CelA功能相关的催化残基、底物结合残基及隧道末端环残基,利用定点突变技术对这些位点的功能进行了研究。结果显示E38、E49和D228是CelA的催化活性残基,其中E49为质子供体,D228为催化碱,而E38在CelA的水解过程中也起到重要作用,突变体E38A、E49A和D228N的酶活性仅为野生型的10%左右。Y100、W312和T107是隧道入口或隧道内可能与底物结合相关的残基,突变体Y100A、T107A及W312A的酶活性分别为野生型的34%、59%和28%,这些残基可能参与对糖链进入活性位点的引导,其中芳香族残基起到的作用更大。末端环上的氨基酸残基E591、E592突变为具有小侧链的丙氨酸后,剩余酶活分别为野生型的48%和51%,说明末端环的灵活性对产物释放影响不大,可能通过与产物产生氢键引导它们排出裂隙。(4)CBM结构域对CelA催化特性的影响利用融合PCR技术将CelA催化结构域与碳水化合物结合结构域CBM串联,重组的杂合酶活性急剧下降,仅为野生型的9.8%,酶的最适反应温度及最适反应pH值没有改变,但稳定性下降。
【图文】：

纤维素,植物细胞壁,微纤维,层结构

类也能产生纤维素 II，但大多数如纤维素 III 和 IV，它可以通过化学处理由纤维素 I 制备[15,16]。天然纤维素主要由纤维素 Iα和 Iβ构成， Iα和 Iβ的比例根据纤维素的来源而变化。通常，高等植物的细胞壁富含纤维素 Iβ，而纤维素 Iα主要存在于藻类或细菌的细胞壁[16,17]。纤维素 Iβ由纤维素 Iα在原纤维形成过程中弯曲转化而成[18]。

氏族,糖苷,水解酶,家族

（3）分裂性功能，一些 CBM 似乎具有破坏多糖结构的能力，，这强了催化模块的降解能力，但这种现象的普遍性是不确定的[90]。化模块可以与不同来源的各种尺寸和结构的 CBM 组装，几乎没有限催化模块之间的协同作用，所得的纤维小体或嵌合纤维素酶对结晶到改善。对结晶纤维素的水解活性的增强可间接反映 CBM 的破坏作究是零星的而不是系统的，各种 CBM 的破坏活性无法相互比较。在人的研究中，利用 CBM 和催化模块的协同作用，定量分析 CBM 通过研究嵌合纤维素酶的活性，可以研究 CBMs 的特征。催化结构域维素酶的催化结构域分布在许多糖苷水解酶家族中，因为蛋白质的列更保守，所以一些拥有相同折叠方式和催化机制的糖苷水解酶家（GH Clan）。它代表了 CAZy 分类层级的更高级别，并且目前仅针类。通用的命名方式为：GH- 字母，比如：GH-A，字母仅反映氏族家族的氏族归属通常遵循结构鉴定。图 1-2 列出了一些糖苷水解酶结构特征。
【学位授予单位】：东北师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q78;Q936

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