具有生化功能的泛素Toolboxes的合成新策略研究

发布时间：2020-04-19 03:31

【摘要】：蛋白质作为生命活动的物质基础,在生物体内发挥着非常重要的作用。其中,蛋白质上存在多种翻译后修饰(PTMs),如磷酸化、乙酰化、甲基化、泛素化等,这些修饰调控着蛋白的结构并可以显著改变蛋白的生理功能。其中泛素作为一种由76个氨基酸组成的小分子蛋白,与其它的翻译后修饰不同,它的作用方式更加复杂,并几乎参与细胞生命周期的各个方面,如转录调节、蛋白质降解、细胞凋亡、DNA损伤修复等生理过程。泛素化的过程是通过由E1激活酶(Els),E2结合酶(E2s)和E3连接酶(E3s)组成的酶联级反应进行的。人体大约有600多个E3酶,根据它们存在的特征区域与催化转移的机制分成不同家族:RING(Really Interesting New Gene),HECT(homologous to the E6AP carboxyl terminus)和RBR(RING-between RING-RING)。泛素化过程也可以由不同的去泛素化酶(DUB)进行逆向调控。这些酶的活性在体内受到严格监管,一旦发生遗传改变、异常表达或者功能障碍通常会导致一些病理性疾病,譬如E3连接酶Parkin的突变造成早发型的常染色体隐性遗传性;DUB中USP28在结肠和乳腺肿瘤中过表达。由于泛素自身含有七个不同位点的赖氨酸(K6,K11,K27,K29,K33,K48,K63)以及N端甲硫氨酸(Met)裸露的氨基(M1),导致泛素自身形成不同长度的单一链型的泛素链和多个链型的混合、分支泛素链。而这些不同链长及链连接类型直接导致了不同泛素链之间具有较大生理功能差异。为了对泛素相关的复杂体系进行探索,目前有三方面研究正蓬勃开展:1.运用均一的泛素链样品开展泛素相关的生物化学、生物物理以及结构生物学探索,以揭示不同链型的泛素链调控修饰蛋白的生物化学机制。2.发展泛素相关活性探针对不同细胞环境中的多种酶活性进行监测并研究它们在癌症发展过程中的作用机制。3.发展泛素荧光试剂对泛素相关酶的活性进行直接和定量检测,并用于相关抑制剂的筛查。针对以上三方面本文开展了研究工作,主要包括:第一部分工作中,我们发展了一种实用的方法,将辅基修饰的泛素单体作为连接单元构建泛素链。该策略的优点是所有的单体原料可通过细菌重组表达的方式容易的获取,这允许泛素单元的同位素标记并用于NMR的结构分析。使用该泛素单元通过辅基介导的自然化学连接(NCL)策略我们合成了多种泛素链,不仅制备了单一链型的K48和K6连接的三泛素,还制备了由K48,K6组成的混合链型的三泛素。DUB水解实验进一步验证了它们良好的生物活性。我们预计该方法可进一步拓展到泛素化蛋白的合成中,为泛素相关生物化学和生物物理研究奠定基础。第二部分工作中,我们发展了一种简易的基于酰肼的NCL及连续脱氢丙氨酸(Dha)形成的策略制备E2-Ub-Dha探针。制备该探针的操作简单,并且所用材料均已商业化,所以该策略可在普通实验室中实施。运用E2-Ub-Dha探针我们不仅实现了对体外表达的HECT E3酶的有效标记,而且对复杂细胞裂解液环境中的HECT E3酶也可进行标记。该探针的开发将有助于我们理解HECT E3酶在不同细胞环境中的作用和功能,并可进一步促进相关抑制剂的研发。第三部分工作中,我们发展了一种有效的策略合成Ub-AMC,合成过程仅需通过两片段的基于酰肼的NCL以及一锅连接脱硫的方式就可实现。另外,我们使用了正亮氨酸(Nle)代替甲硫氨酸(Met)大大减少了氧化副产物的出现并提供了很高纯度的最终产物。经生物活性实验验证,合成的Ub-AMC具有很好的生物活性。我们预计这种合成策略可进一步应用到其它泛素荧光试剂的合成中,为相关去泛素化酶的抑制剂筛查提供原料。总之,本篇论文围绕发展新型策略制备泛素链,泛素探针以及泛素荧光试剂(三者统称为泛素toolboxes)用于泛素相关生化研究。我们预计相关技术的发展将进一步为研究泛素信号通路及其生理机制奠定基础。
【图文】：

逦第１章逦逡逑由其它非常规位点（Ｍｌ，邋Ｋ６，邋Ｋｌｌ，Ｋ２７，邋Ｋ２９或Ｋ３３）所组成的单一链型的泛逡逑素链而被称为非经典泛素链，此外，非经典泛素链还包括在一个多聚泛素链上存逡逑在多种连接类型的混合（ｍｉｘ）或分叉（ｂｒａｎｃｈ）泛素链。【１２］这些泛素链因为在逡逑细胞中的含量较少或是难以在体外获得而对其功能研究的尚不深入。逡逑

逦第１章逦逡逑蛋白连接后作为一种分子信号进行某种信号传导。【１９］比如，，Ｋ６３泛素链可以调节逡逑ＮＦ－ｋＢ转录因子的激活，还可以参与免疫应激反应、ＤＮＡ修复和受损线粒体的逡逑清除等，此外，它们也可以与其它多种蛋白形成大型复合物从而驱使ｍＲＮＡ的逡逑剪接或翻译。［２（）］在体内发现与形成Ｋ６３泛素链相关的Ｅ２酶和Ｅ３酶以及它的受逡逑体蛋白（ＵＢＤ）都参与相关通路的信号转导而并非参与蛋白质降解。［２１］Ｋ６３泛逡逑素链在体内也有多种专一的ＤＵＢ，如ＣＹＬＤ、八＼４５１＾等［２２］。逡逑
【学位授予单位】：中国科学技术大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q51


本文编号：2632878