桂花类胡萝卜素裂解关键基因CCD1的克隆及功能研究
发布时间：2020-04-20 13:38
【摘要】：类胡萝卜素及其衍生物不仅是许多抗逆物质生物合成的前体物,而且还调控植物花色、香气风味等,广泛应用于医药、卫生、食品、保健等行业。类胡萝卜素的裂解受类胡萝卜素裂解双加氧酶(carotenoid cleavage dioxygenase,CCDs)调控。CCDs是植物体内类胡萝卜素裂解代谢途径中的关键酶,含有9个成员,其中CCD1的调控机制最为复杂。为了深入研究桂花OfCCD1基因在香气生物合成中的生理功能,本研究采用RACE-PCR技术克隆桂花的OfCCD1基因,并进行核酸序列、蛋白质序列的分析,了解其结构特点;利用半定量PCR方法研究OfCCD1基因表达模式与含量变化,明确其表达规律;采用原核表达的方法进行诱导、纯化CCD1蛋白质,鉴定其氧化酶活性;利用叶盘法转化法和花序浸染法转化烟草和拟南芥,揭示其生理功能,取得如下实验结果:1、核酸序列分析结果表明,桂花OfCCD1基因的完整开放读码框(ORF)长度为1632 bp,编码的蛋白质序列含有543个氨基酸,分子式为C2785H4294N7200791S24,相对分子质量约为61288.52,理论等电点为6.27,脂溶指数80.77,总平均疏水指数为-0.262。其二级结构主要由α-螺旋(11.60%)、无规则卷曲(58.38%)、延伸链(23.76%)和β-转角(6.26%)组成,其蛋白质三维结构与玉米中的同源蛋白质VP14相似度最高;2、金桂、银桂、丹桂和四季桂OfCCD1基因均在香眼期时表达水平最低,依次在盛花初期、盛花中期、盛花中期和盛花初期时达到峰值,表明OfCCD1基因的表达丰度因桂花种类的不同而存在差异性表达,且具有时空特异性;3、0.5 M浓度的IPTG可以诱导OfCCD1蛋白的表达,通过镍柱纯化可以得到目的蛋白,分子量约为64KDa;同时利用His抗体进行鉴定,可以观察到目的条带,大小与目的蛋白相符合;4、采用叶盘法转化烟草植株,通过抗性筛选获得了抗性转基因植株,同时利用半定量PCR进行检测,可以扩增到OfCCD1基因;采用花序浸染法转化拟南芥植株(Col-0),获得了 OfCCD1过表达的阳性植株,为进一步研究OfCCD1的生理功能奠定了基础。
【图文】：
２．２结果与分析逡逑２．２．１桂花总ＲＮＡ的提取逡逑提取桂花花瓣总ＲＮＡ，１．５％琼脂糖凝胶电泳检测。结果表明（图３），逡逑２８Ｓ邋ｒＲＮＡ及１８Ｓ邋ｒＲＮＡ条带清晰，无降解，说明提取的ＲＮＡ可以用于之逡逑后的反转录和ＰＣＲ实验。逡逑１１逡逑
又非常有特色，在超氧化物还原酶、富马酸还原酶中常见。它由七叶片＾逡逑螺旋桨组成，螺旋桨轴上的四个组氨酸，，可以固定Ｆｅ２＋离子，从而标记逡逑酶活性中心（图８邋）。逡逑：S茫义贤迹稿澹埃茫茫模钡鞍酌富钚灾行腻义希疲椋纾福澹牛睿恚邋澹粒悖簦椋觯椋簦澹茫澹睿簦澹蝈澹铮驽澹希妫茫茫模戾义希保跺义
本文编号：2634602
【图文】：
２．２结果与分析逡逑２．２．１桂花总ＲＮＡ的提取逡逑提取桂花花瓣总ＲＮＡ，１．５％琼脂糖凝胶电泳检测。结果表明（图３），逡逑２８Ｓ邋ｒＲＮＡ及１８Ｓ邋ｒＲＮＡ条带清晰，无降解，说明提取的ＲＮＡ可以用于之逡逑后的反转录和ＰＣＲ实验。逡逑１１逡逑
又非常有特色，在超氧化物还原酶、富马酸还原酶中常见。它由七叶片＾逡逑螺旋桨组成，螺旋桨轴上的四个组氨酸，，可以固定Ｆｅ２＋离子，从而标记逡逑酶活性中心（图８邋）。逡逑：S茫义贤迹稿澹埃茫茫模钡鞍酌富钚灾行腻义希疲椋纾福澹牛睿恚邋澹粒悖簦椋觯椋簦澹茫澹睿簦澹蝈澹铮驽澹希妫茫茫模戾义希保跺义
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