基于RNA-Seq对捕食线虫真菌虫生亚隔指孢做转录组学分析

发布时间：2020-04-24 10:42

【摘要】：线虫每年对农作物造成相当大的损失,由于传统的防治线虫措施与喷洒化学农药的局限性迫切需要一种对环境友好且高效的线虫生防制剂。捕食线虫真菌(Nematode-trapping fungi)生活方式灵活且是杀线虫生防制剂研究最多的,其原本能在土壤中营腐生生活,当处于低氮源环境且有活线虫或线虫提取物存在的条件下其营养菌丝会特化形成捕食器官(捕器),捕器的生成标志着生活史的改变,捕器可分为三维菌网、粘球、粘性分枝和的收缩环等类别。捕食线虫真菌杀线虫共分为4步:吸引、固定、侵入、消化。虽然当下用于杀线虫的生防制剂已有报道,但由于线虫的生活条件限制了捕食线虫真菌的杀线虫效果,且捕食线虫真菌与线虫的相互作用及相关机制也不是很清楚,所以继续探究捕食线虫真菌杀线虫的机制还是相当的有建设性意义的。本文基于RNA-Seq技术对在加入秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)稀释液0 h、24 h、72 h三个时间后产粘球的捕食线虫真菌虫生亚隔指孢(Dactylellina entomopaga)的进行转录组学分析,以挖掘更多的毒力因子及相关的毒力基因从而完善捕食线虫真菌的浸染机制信息库。分析方法:使用 Blast2GO 软件进行 Non-Redundant Dataset(NR)和 Gene Ontology(GO)以及InterProScan的blast 比对;将clean reads比对到基因组上并计算出每个基因的reads数目(count值)使用edgeR软件基于reads计数的方法筛选得到显著差异基因(Significantly differentially expressed genes,SDEGs);对显著差异基因进行多个蛋白质数据库注释和富集。本文发现:未诱导状态到诱导前期,显著上调差异基因富集到的Pathway有核糖体与氮代谢;诱导前期到诱导后期显著上调差异基因富集的Pathway是过氧化物酶体;未诱导状态到诱导后期,显著上调差异基因富集的Pathway为核糖体、产热、MAPK信号通路、氧化磷酸化、酪氨酸代谢、黑素原生成、河马信号通路等。依据多篇文献报道还假设:在连续上调的基因中,蛋白质注释结果显示:可能编码蛋白为c型凝集素家族的基因de0208146可能与粘附过程相关,de0201759也许参与定位线虫;从诱导前期到诱导后期上调三十多倍的de0200602可能参与了线虫的识别;de0204621可能与捕器粘性产生有关。
【图文】：

图２－１：邋ＲＮＡ－Ｓｅｑ测序流程图逡逑２．３转录组分析逡逑转录组学分析的流程如图２－２所示，具体如下文所述。逡逑２．３．１测序结果质厘彳￡制逡逑在进行一系列分析之前必须对测序结果初始下机数据（ｒａｗ邋ｄａｔａ）进行评估，逡逑评估项目有：检查ｒｅａｄｓ每个位置的碱基测序质量，每条序列的测序质量、是否有逡逑接头残留情况、不识别的碱基含量等。本实验使用ＦａｓｔＱＣ邋（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａ逡逑ｔｉｃｓ．ｂａｂｒａｈａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｆａｓｔｑｃ／）对测序数据进行质量控制，接着使用Ｍｕ丨ｔｉＱＣ逡逑［２３］对结果进行整合。逡逑２．３．２基因组比对及ｒｅａｄｓ的定量逡逑由于在构建ｃＤＮＡ文库以进行测序之前，是在ｍＲＮＡ中加入特定的打断试剂逡逑将其打断成短序列，接着以打断的ｍＲＮＡ作为模板反转录生成ｃＤＮＡ，再经过一逡逑系列的操作后进行测序的，，因此使用ＨＩＳＡＴ２邋（ｃｃｂ．ｊｈｕ．ｅｄｕ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｈｉｓａｔ２／ｉｎｄｅｘ．ｓｈ逡逑ｔｍｌ）将ｒｅａｄｓ比对到参考基因组上以了解ｒｅａｄｓ在参考基因组上的位置。逡逑在上一步的基因组比对后得到了哪些ｒｅａｄｓ是属于哪个基因的，接着使用逡逑ｆｅａｔｕｒｅＣｏｕｎｔｓ［２４Ｈ十算比对到所有基因的ｒｅａｄｓ数（ｃｏｕｎｔ）为使用ｅｄｇｅＲ软件算出基逡逑因的表达丰度变化以找出差异表达基因。逡逑８逡逑

（错误率在０．１邋％以下）之间的，说明每条序列的测序质量都挺好，结果通过；逡逑测序过程中ｒｅａｄｓ的某个位置的碱基无法确定为哪种碱基时则将其标记为Ｎ，在任逡逑意位置的Ｎ邋％邋＞邋５时该模块就生成一个警告，从图３－４可以看出所有的位置Ｎ邋％都逡逑远远小于５，说明测序结果有着很小的数据读取偏差。综合上述结果认为该下机逡逑数据可以用于后续的转录组学分析。逡逑ＦａｓｔＱＣ：邋Ｍｅａｎ邋Ｑｕａｌｉｔｙ邋Ｓｃｏｒｅｓ逡逑ｓｏ逦NB：邋：逦＇匕二＇．：：土．…广Ｖ．逡逑４０逡逑ｇ邋３0逡逑Ｉ逡逑？逡逑２０逦４０逦６０逦８０逡逑Ｐｏｓｉｔｉｏｎ邋（ｂｐ）逡逑图３－２：邋ｒｅａｄ的第１￣９０个碱基的测序质量情况逡逑图中共有六条绿线，分别代表测序的六条序列。横坐标表示ｒｅａｄｓ的第１？９０逡逑个碱基，纵坐标表示碱基测序质量打分（Ｑ邋＝邋－１０邋＊邋ｌｇＰ其中ｐ表示的是碱基测序错逡逑误率）的平均数，图中共有三个背景色，依次是绿色（表示的是Ｑ＞邋３０碱基测序逡逑错误率在０．１邋％以下，而正确率在９９．９％以上），当打分在此区域时表示达到了逡逑很好的测序质量；在黄色区域时表示是处于相对合理的范围；当打分落在红色区逡逑域时即为测序质量较低的情况。逡逑１３逡逑
【学位授予单位】：云南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q93;Q78

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本文编号：2638876