AtGPRP3基因在拟南芥幼苗生长中的功能分析

发布时间：2020-04-24 14:52

【摘要】：广泛分布于植物中的GPRP(Glycine and proline-rich protein)蛋白家族基因已被报道在植物的生长发育过程中具有重要的作用。然而,目前很少见对植物中GPRP蛋白基因功能进行深入研究的报道。本研究以已报道的、尚未见生物学功能研究的拟南芥AtGPRP3基因为研究对象,在分析该基因基本特点、蛋白进化关系和表达特性的基础上,进一步创建了AtGPRP3基因的过量表达、CRISPR敲除缺失表达及其功能互补转基因材料,并对其在拟南芥幼苗生长发育过程中的作用进行了分析,初步发现AtGPRP3基因影响拟南芥幼苗的生长速率。为深入研究AtGPRP3基因的生物学功能奠定了基础。主要实验结果如下:1.拟南芥AtGPRP3基因的基本特点、蛋白进化关系和表达特征通过生物信息学分析发现,AtGPRP3基因包含2个外显子和1个内含子,共编码179个氨基酸,蛋白等电点(pI)为9.75,分子量(Mw)为17.8 kDa。蛋白进化分析结果表明,GPRP蛋白家族基因在单子叶和双子叶中不存在明显的分化。GUS染色和qRT-PCR结果显示,AtGPRP3基因主要在拟南芥的连座叶和茎上叶中的表达量较高,在成熟的果荚中表达较少。亚细胞定位结果表明,AtGPRP3蛋白主要在细胞核中表达。2.AtGPRP3的过量表达、缺失表达及其功能互补转基因拟南芥材料创建以pCXSN质粒构建了AtGPRP3的过量表达载体,利用Yao.ATU6_35s.HPT和pCAMBIA1300-Myc质粒分别构建了AtGPRP3的CRISPR敲除缺失表达突变体及其功能互补转基因遗传材料,目前已获得了AtGPRP3基因的过量表达、CRISPR敲除缺失表达及其功能互补转基因纯合株系各3种类型,用于后续的功能分析实验等。3.AtGPRP3影响拟南芥幼苗的生长发育分别在pH5.8和pH8.0两种培养基上种植野生型拟南芥、AtGPRP3基因的过量表达、缺失表达及其功能互补转基因拟南芥材料,对各种材料幼苗地上部鲜重进行统计分析结果显示:与野生型拟南芥幼苗地上部鲜重相比,AtGPRP3过量表达转基因植株幼苗地上部的鲜重显著减少,AtGPRP3缺失表达转基因植株幼苗的地上部鲜重显著增加,而功能互补转基因植株幼苗地上部鲜重与野生型的差异不显著。这些结果表明AtGPRP3对拟南芥幼苗地上部的鲜重可能具有负调控作用,进而影响拟南芥苗期的生长速率。4.AtGPRP3互作基因的筛选、鉴定与转基因功能验证在拟南芥幼苗cDNA酵母筛选文库构建和初筛的工作基础上,进一步开展了酵母双杂(Y_2H)和双分子荧光互补(BiFC)实验鉴定等,共获得了3个AtGPRP3的互作基因AtCAT2、AtCLC3和AtCYSD1。进而利用CRISPR-Cas9技术,重点创建了互作基因AtCAT2的缺失表达拟南芥转基因突变体,并分别于pH5.8和pH8.0的两种培养基上种植生长,对其幼苗地上部鲜重进行统计分析结果表明:与野生型拟南芥幼苗地上部鲜重相比,AtCAT2的CRISPR敲除缺失表达突变体幼苗地上部鲜重显著降低。这一结果与AtGPRP3过量表达转基因株系的表型类似;由此,我们初步推测:AtGPRP3与AtCAT2结合对AtCAT2本身的作用可能具有抑制的效果,但有待进一步实验证实。
【图文】：

示意图,向光性,光敏色素,信号传递

图 1.1 植物向光性过程中光敏色素介导的信号传递示意图[7]Fig. 1.1 Schematic diagram of phytochrome-mediated signal transmission phototropism物对应的光谱范围从近紫外（UVB）280~315nm 波长到远红外（F 波长的整个波段，植物对光谱的几个部分具有各自不同的光感受器，

生长素,组分,细胞溶质,途径

图 1.2 生长素感知和传导信号的关键组分[1.2 Key components in auxin perception and siA）主要由前体物质经过草莽酸途径产生，的前体化合物，包括芳香族氨基酸、生物香代谢物，是类黄酮和原发性植物次生代草莽酸途径的最终产物[16]。在植物体内，）和 ATP-BINDING CASSETTE B（ABCB生长素通过 AUXIN 1（AUX1）/ LIKE-AU形式通过扩散进入细胞[18]。Dahlke 等发现由不同的生长素信号通路所导致[19]。酸（ABA）由类胡萝卜素合成，经 CYP70都可被感知，细胞溶质性 PYR / PYL / RC / PYL / RCAR 受体结合后会激活 SnRK2 核中的 ABF /AREB /ABI5 碱性亮氨酸拉链而可以调控众多的植物生长发育过程。
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q943.2

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