LIS1在肺和肢体发育过程中的作用及其机制研究

发布时间：2020-04-28 08:26

【摘要】：LIS1(Lissencephaly 1,也叫PAFAH1B1)对于动力蛋白Dynein所介导的胞内物质运输及高尔基体、胞内体、溶酶体和线粒体的正确定位是必需的。Lisl基因也是第一个被确认与神经元迁移疾病有关的基因,它在人体中的杂合缺失会导致严重的大脑畸形疾病,该疾病主要表现为脑回的缺失,灰质体积的增加以及白质体积的减少,因而称之为无脑回畸形疾病。近几年来,对于Lisl基因的功能研究主要集中在大脑神经系统发育以及无脑回疾病致病机理上,而对于Lisl基因在其他组织器官发育中的功能知之甚少。为了探究Lisl基因在组织器官发育过程中的相关功能,我们分别建立了肺上皮细胞Lisl基因特异性敲除小鼠模型以及四肢间充质细胞Lisl基因特异性敲除小鼠模型。通过对E18.5的小鼠胚胎的表型分析,我们发现Lis1 KO小鼠胚胎肺和四肢未形成。对小鼠早期胚胎肺和四肢进行TUNEL以及pHH3染色,我们发现Lisl KO小鼠胚胎肺上皮细胞和四肢间充质细胞中存在大量的细胞凋亡,而细胞增殖却与对照小鼠无差异。进一步通过对小鼠胚胎进行原位杂交实验,我们发现FGF信号通路下游靶基因在Lisl KO小鼠胚胎肺和四肢中的表达位置存在异常,并且其表达强度也低于对照小鼠。此外,对E10.5时期Lisl KO小鼠前肢进行RNA Seq测序分析,我们发现Lisl基因的敲除的确会影响FGF信号通路的正确转导。与此同时,通过利用KrasLSL-Gl2D/+转基因小鼠模型来激活FGF信号通路下游的MAPK信号通路,我们发观ShhCre;Lislf/f;KrasLSL-Gl2D/+以及Prxl Cre;Lislf/f;Kras LSL-Gl2D/+小鼠胚胎肺和四肢的发育缺陷会得到部分的修复。这个结果进一步说明Lisi KO小鼠的肺与四肢中FGF信号通路被抑制。为了在细胞及分子水平研究Lis1基因如何调控FGF信号通路,我们分离并建立了永生化的Lislf/f MEF(小鼠胚胎成纤维)细胞,在细胞水平上进一步验证发现当Lisl基因在MEF细胞中被敲除后,FGF信号通路的转导会出现阻滞。通过免疫共沉淀实验,我们发现LIS1及其相互作用蛋白NDE1/NDEL1与FGF受体在体内存在一定的相互作用。并且,免疫荧光以及Western Blotting实验结果也显示LIS1能够调控FGF受体在胞内的定位以及蛋白质稳定性。值得注意的是,FGF信号通路的激活还能促进NDE1酪氨酸磷酸化,随后,进一步导致LIS1/NDE1复合物发生解离。因此,我们的研究结果表明,LIS1对于小鼠胚胎肺和四肢的正常发育至关重要。并且,我们的研究也确定了LIS1/NDE1复合物是FGF信号通路的一个重要调节因子,为FGF受体在细胞内转运机制和内吞作用的双向调节提供了新的见解,更重要的是,我们的研究也为阐明LIS1/NDE1突变所导致相关遗传疾病的分子机制提供了一个新的方向。
【图文】：

浙江大学博士学位论文逦引言逡逑迁移，其成体层组织依旧正常。若ＬＩＳ１蛋白的表达剂量过低，则会阻塞大脑皮质逡逑和海马组织的正常发育［２０－２２］。这种情况下，不仅大脑组织发育会受影响，而且运逡逑动能力、学习能力和记忆能力都会相应的下降［２３］。当Ｌｂ／基因处于亚效等位基因逡逑状态时，会出现大脑神经元迁移短暂抑制，神经元细胞分裂异常，大脑胶质细胞形逡逑态呈放射状，以及地中海运动皮层的神经支配延迟等现象［２４－２６］。由于绝大多数无逡逑脑回疾病患者也存在中间神经元的切向迁移异常Ｐ７］，，与此类似的发育缺陷可能也逡逑是导致无脑回疾病患者vr痫发作的原因之一。逡逑

脑回疾病患者也存在中间神经元的切向迁移异常Ｐ７］，与此类似的发育缺陷可能也逡逑是导致无脑回疾病患者vr痫发作的原因之一。逡逑图１．１无脑回疾病患者大脑核磁共振图［２８］。图中显示了邋５例与ＬＩＳ１相关的无脑回畸形患者逡逑的轴位脑扫描图像，按照疾病的严重程度可分为６个等级。１显示完全的无脑回，２ａ显示弥漫逡逑性无脑回，３ａ显示脑后部无脑回且额巨脑回，４ａ显示弥漫性或部分肥厚性脑回，６ａ显示脑皮逡逑层下带异位。逡逑１．１．２邋ＬＩＳ１的蛋白结构及其相关生理功能逡逑基因位于人类１７号染色体１７ｐｌ３．３区域［１１］，长度约为９２ｋｂ，包含１１个逡逑外显子，编码含４１０个氨基酸的ＬＩＳ１蛋白。ＬＩＳ］蛋白包含两个结构域，这两个结逡逑构域对于ＬＩＳ１蛋白的二聚化起着非常重要的作用［２９－３１］。ＬＩＳ１蛋白Ｎ端由一个逡逑ＬｉｓＨ结构域和一个卷曲螺旋结构域组成。而ＬＩＳ１蛋白的Ｃ端则主要是由７个ＷＤ逡逑重复结构域构成，这些重复结构域对于ＬＩＳ１蛋白与其他蛋白的相互作用起到十分逡逑重要的作用Ｐ２］。经生化纯化分析后，基因编码的蛋白产物被鉴定为血小板活逡逑化因子乙酰水解酶的调节亚单位［３３］。血小板活化因子乙酰水解酶是一种由ＬＩＳＩ逡逑２逡逑
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q344

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本文编号：2643259