W03G11.3基因在两种线虫中的表达特性和调控功能研究

发布时间：2020-04-30 14:28

【摘要】：松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)是松材线虫病(pine wilt disease,PWD)的致病因子。目前,松材线虫病在我国严重发生,造成巨大的经济损失。前期研究发现,蓝光能够显著地抑制松材线虫胚胎发育,进一步研究发现,蓝光处理后许多基因在松材线虫胚胎中的表达量下调,其中W03G11.3基因的表达量显著降低。在前期研究的基础上,本文以松材线虫和模式线虫秀丽隐杆线虫为研究对象,研究W03G11.3基因在两种线虫中的表达特性和调控功能;采用Semi Quantitative PCR方法分析W03G11.3基因在两种线虫整个生命周期中表达量的变化;构建W03G11.3基因质粒表达载体,采用转基因显微注射和in situ组织原位杂交技术,分析其时空动态表达特性;采用RNAi技术研究该基因在两种线虫个体发育过程中的调控功能。具体研究结果如下:1、Semi Quantitative PCR结果表明,W03G11.3基因在松材线虫和秀丽隐杆线虫个体发育的各个阶段都有表达。在松材线虫中胚胎期到2龄期表达量稳定,3龄期表达量明显升高,3龄期到成虫期表达量保持稳定,同时雄性成虫和雌性成虫之间无差异表达;相比松材线虫,秀丽隐杆线虫胚胎期到成虫期表达量趋于稳定,但在雌雄同体的个体和雄性个体之间表现出差异表达,雌雄同体个体中表达量更高。2、in-situ原位杂交结果表明,W03G11.3基因在松材线虫胚胎早期桑葚期体壁肌肉前体细胞中表达,当胚胎发育至逗号期,则在幼虫体壁肌肉表达;从幼虫期到成虫期在松材线虫体壁肌肉和肠道中稳定表达。3、转基因显微注射研究结果表明,W03G11.3基因在秀丽隐杆线虫胚胎早期逗号期开始表达,从胚胎期到成虫期表达稳定,主要集中在体壁肌肉、尾部泄殖腔控制肌肉和肠腔肌肉中表达,同时还在成虫子宫内部平滑肌中表达。4、RNAi结果表明,W03G11.3基因表达受双链RNA干扰后,松材线虫30h内胚胎孵化率,由正常的85.36%降至50.07%,影响线虫肌肉的正常发育,同时2龄期和成虫期线虫20 s内头部摆动频率,干扰后由正常的16.5、20.1次降至2.3、7.3次,线虫出现严重的运动缺陷;成虫12h内产卵量,由正常的13.7颗降至2.8颗,雌虫产卵数量显著减少,同时导致线虫寿命缩短;相比之下秀丽隐杆线虫胚胎孵化率虽有所下降,但不显著,而成虫12h内产卵量由正常的9.3颗降至3.9颗,产卵总数显著降低。上述研究结果不仅明确了W03G11.3基因在松材线虫和秀丽隐杆线虫的时空动态表达特性和对个体发育的调控功能,也为揭示蓝光抑制松材线虫和秀丽隐杆线虫胚胎发育并导致种群数量减少的内在原因提供理论基础。
【图文】：

蛋白质序列,秀丽隐杆线虫,松材线虫,基因进化

3 结果与分析松材线虫和秀丽隐杆线虫W03G11.3基因生物信息学分析使用 emboss pairwise序列分析 W03G11.3 基因，发现与人体内 α-L-岩藻糖具有 41.7 ％同一性和 57.5 ％相似性（图 1A）；但与禾谷镰刀菌 GH95 家-L-岩藻糖苷酶仅有 20％的同一性和 33％的相似性（图 1B）。比对结果表W03G11.3 基因属于 GH92 家族α-L-岩藻科并且功能相似。此外，序列分揭示了松材线虫和秀丽隐杆线虫 W03G11.3 基因中的潜在信号肽，表明G11.3 基因是潜在的分泌蛋白（图 1A）。为了分析与其他物种的进化关系具有完整蛋白质序列的系统发育树，以表明α-L-岩藻糖苷酶存在线虫特异歧（图 1C）。此外，还观察到其他 6 个分支，包括 Chordata，Arthropodrthropada，Nematoda，Bacteria 和 Fungi（图 1C），反映出不同门之间的进系。

松材线虫,基因编码区,线虫

图 2松材线虫RNA电泳结果ectrophoresis results of Bursaphe转录松材线虫混虫RNA反转 Kit with gDNA Eraser反转260/280 为 1.80，260/230 为.3 基因编码区获取线虫 W03G11.3 基因编码60/280 为 1.90，260/230
【学位授予单位】：浙江农林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S763.7;Q953

【参考文献】