产碱性蛋白酶菌株BN-2的鉴定及其重组酶的酶学性质表征

发布时间：2020-05-05 21:41

【摘要】：蛋白酶是能将蛋白质降解为小肽和氨基酸的水解酶,碱性蛋白酶(Alkaline protease,AP)作为在碱性环境下活力较高、稳定性较好的一类蛋白酶,其在洗涤剂、生物修复、废物管理、摄影、诊断等工业中均有应用。微生物源碱性蛋白酶因生产成本低、生产率高可满足工业上的需求,成为碱性蛋白酶生产的重要来源,在微生物中,细菌和真菌是各种碱性蛋白酶的良好来源。目前,芽孢杆菌属细菌如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜碱性芽孢杆菌等是适用于工业生产的主要产酶菌株。本文主要从自然环境中筛选出一株产酶活性较高的菌株,并对菌株中碱性蛋白酶进行了相关研究。首先,从自然发酵的大豆中分离出一株产蛋白酶活性较高的菌株BN-2,结合形态学、分子生物学鉴定该菌种为Bacillus subtilis subsp.natto BEST195。然后通过CTAB法成功提取了BN-2菌株中基因组DNA,利用PCR技术扩增出该菌株中碱性蛋白酶(Alkaline protease,AP)基因,插入pBE2R载体中,构建成重组表达载体pBE2R-AP,并转染枯草芽孢杆菌WB600进行分泌性表达。以糊精、可溶性淀粉作为碳源,每毫升发酵液中重组蛋白酶的酶活约是出发菌株中蛋白酶酶活的1.2倍。将pBE2R载体中p43启动子替换为BN-2菌株中碱性蛋白酶的p195启动子时,每毫升发酵液中p43启动子调控下的碱性蛋白酶酶活约是p195启动子调控下酶活的1.4倍。以酪蛋白为底物对该重组蛋白酶的酶学性质进行了研究,结果表明:该酶的最适作用pH为8.0,在pH 8.0缓冲液中保存24 h,剩余酶活力达94%;该酶的最适作用温度为50℃,在50℃中处理30min时残余酶活力降至51%;1mmol/L的Mn~(2+)使该酶活性提高了48%,1mmol/L的Ca~(2+)使该酶活性提高了8%;洗涤剂组分中1%的TritonX-100对该酶活性有13%的抑制作用,1%的Tween20对该酶活性有8%的抑制作用,1%的Tween80对该酶活性有15%的抑制作用。
【图文】：

氨基酸序列,蛋白酶,催化域,系统发育树

由于其对蛋白质底物作用位点不同，可分为一步可分为六类不同蛋白酶[3]。其中丝氨酸蛋白酶中丝氨酸是其必需的催化残基。丝氨酸蛋同源性分为胰凝乳蛋白酶样蛋白酶、脯氨酰基小麦丝氨酸羧肽酶Ⅱ样蛋白酶、粘杆菌溶菌酶枯草杆菌素样蛋白酶又因氨基酸序列的不、嗜热蛋白酶（Thermitase）、蛋白酶 K（Prootic peptidase）、克辛（Kexin）和吡咯（Py]。枯草杆菌素（Subtilisin）又包括六个亚家族、胞内蛋白酶、高分子量枯草杆菌素(HMSs)[5]。最适反应 pH 值的不同，又可分为碱性、中性

洗涤剂,酱汁,产品,餐具洗涤剂

图 1.2 酶的销售分布Fig1.2 Distribution of enzyme sales.酶在洗涤剂中的应用酶作为洗涤添加剂，加入洗衣粉和餐具洗涤剂中，，有渍，如角蛋白、牛奶、酱汁和肉汁等。使用碱性蛋白危害化学品如含磷化合物的使用，同时减轻了环境酶应该在洗涤剂成分例如表面活性剂，助洗剂，漂白物柔软剂和其它各种配方助剂的存在下是稳定和有活水解酶，在水解自身时也会分解产品中其他酶，因此在于有效抑制酶活性，希望在产品贮存过程中抑制酶活力，硼酸和丙二醇体系作为洗涤剂产品中常用的将 4-FPBA 作为抑制蛋白酶酶活的主要试剂[49-53]。目洗涤剂的商品化酶制剂，已经成为洗涤剂产品中必酶在食品中的应用
【学位授予单位】：山西大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q78;Q55

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