CotA漆酶突变体在毕赤酵母中分泌表达及对伊文斯蓝降解机制研究

发布时间：2020-05-06 20:52

【摘要】：漆酶催化酚类和芳香基类化合物的氧化还原反应,利用O_2作为电子受体催化底物,不需辅因子参与,水是反应过程唯一副产物,是典型的环境友好“绿色催化剂”。真菌漆酶虽已商业化,但由于在碱性环境下活性很低甚至失活,热稳定性也较差,大大限制了在印染废水等碱性废水中的应用。相较之下,芽孢杆菌的CotA漆酶,虽天然催化活性略低,但在碱性pH及高温下具有良好酶活,pH与热稳定性非常好,能耐受较高的盐浓度和有机溶剂,更适合在印染废水处理中推广应用。然而CotA漆酶为芽孢外壁蛋白,呈不溶状态,难以分离纯化,限制了CotA漆酶的应用。本论文以巴斯德毕赤酵母表达系统实现CotA漆酶D501G/L386W/G417L/G57F(缩写为GWLF)的分泌表达,该漆酶是本实验室前期构建的来源于短小芽孢杆菌且催化效率有大幅提高的一个优异突变体。根据毕赤酵母的密码子偏好性对GWLF基因进行密码子优化,将优化后的基因整合到毕赤酵母基因组上,成功实现了GWLF在毕赤酵母中的分泌表达。重组GWLF为分子量约75 kDa的二聚体蛋白。在摇瓶水平优化重组毕赤酵母诱导条件,结果表明,将重组毕赤酵母在含有0.25 mmol·L~(-1) Cu~(2+)和0.5%(w/v)山梨醇的BMMY诱导培养基(pH 7.0)中,每隔24 h补加1.0%(v/v)甲醇,在26℃下诱导表达144 h,最终获得GWLF最高酶活为4092 U·L~(-1)。参考摇瓶最适诱导条件,在5 L发酵罐高密度发酵中,重组GWLF最终酶活达到17080 U·L~(-1)。生物毒性实验表明重组GWLF可以有效催化降解偶氮染料伊文斯蓝。通过液相质谱联用技术进一步研究了GWLF对伊文斯蓝的脱色和降毒反应机制,显示伊文斯蓝中的偶氮键在降解过程中转化成氮气而不会生成有毒的苯胺类物质。本研究为首次阐明细菌漆酶催化伊文斯蓝降解机制。
【图文】：

示意图,介体,漆酶,底物

江南大学硕士学位论文被氧化，某些介体小分子可以作为漆酶和底物之间的电子穿梭载体，调节化还原电位，对底物进行间接氧化，形成漆酶介体系统(Laccase-mediato1]。经常使用的介体包括 2,2'-二氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)、丁香醛连三唑、N-羟基-N-乙酰基苯胺、三苯胺、N-乙酰苯胺、紫脲酸等[12]。漆酶介物的机理如图 1-1 所示。LMS 系统的发现扩大了漆酶的底物范围，并且在废纸脱墨、染料降解和生物漂白等中得到了进一步应用。

示意图,漆酶,典型反应,酚类化合物

物的机理如图 1-1 所示。LMS 系统的发现扩大了漆酶的底物范围，，并且在废纸脱墨、染料降解和生物漂白等中得到了进一步应用。图 1-1 有介体存在的情况下漆酶催化底物氧化示意图Fig. 1-1 Laccase-catalyzed oxidation of substrates in the presence of mediator酶的催化机制酶催化反应机制较复杂，主要表现在两个方面[13]：) 生成底物自由基中间体。酶催化氧化酚类和芳胺类底物时,首先从底物分子中获得一个电子，使之成，该自由基并不稳定，可以再次发生聚合或者解聚等非酶催化反应[1]，漆子后呈还原态，在氧气的存在下，还原态的漆酶被氧气氧化，氧气最终被细反应过程如图 1-2 所示[14]:
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q78

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