甜瓜CmHsp70-9及CmXTH28-2基因的克隆及其在果实发育中功能的初步鉴定
发布时间：2020-05-09 06:26
【摘要】：甜瓜(Cucumis melo L.)是一种普遍栽培且具有较高经济价值的园艺作物,其储存及运输成为影响经济价值的重要因素。热休克蛋白(Heat shock proteins,HSPs)作为一种分子伴侣,具有抗应激、抗氧化、调节细胞凋亡等重要的生物学功能。木葡聚糖内转糖苷酶(Xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase,XTH)属于细胞壁松弛酶,在果实成熟阶段对细胞壁的重构起重要作用。本研究以甜瓜品种河套蜜瓜(Cucumis melo L.cv Hetao)为研究材料,对本实验室前期完成的甜瓜果实转录组数据进行分析,从上述两个基因家族中各选取一个在果实发育过程中呈显著差异表达的基因CmHsp70-9和CmXTH28-2,分析生物信息学特性,分析两个基因在甜瓜不同组织和不同发育时期果实中的表达谱,克隆其cDNA序列,并分别构建超表达载体和基因编辑载体,对甜瓜进行遗传转化,对T_1果实进行表型鉴定,获得了以下主要结果:1.生物信息学鉴定获得10个Hsp70和3个IIIB亚类XTH家族成员,通过分析发现两个基因的成员在结构和进化上是相对保守的。2.表达谱分析显示:CmHsp70-9和CmXTH28-2均在果实中表达,四个时期中呼吸跃变后期表达量最高,生长期表达量较低,且两者在根茎叶中均有一定量的表达。3.应用RT-PCR方法克隆出CmHsp70-9和CmXTH28-2各自的cDNA,长度分别为2131 bp和1190 bp。4.用CmHsp70-9和CmXTH28-2基因的超表达载体pPHsp70、pPXTH28和基因编辑载体pYL-Hsp70、pYL-XTH28对甜瓜进行遗传转化,获得的T_1代种子,PCR检测转化植株的阳性率发现:pPHsp70:14.28%;pYL-Hsp70:8.33%;pPXTH28:17.85%;pYL-XTH28:13.09%。对T_1果实成熟期观察表明,对照果实平均成熟时期为46天,获得转化pPHsp70超表达载体T_1果实11个,其平均成熟时期为43天,比对照早熟3天;获得转化pYL-Hsp70编辑载体的具有晚熟表型的T_1果实1个,其成熟期为55天,比对照晚熟9天。获得转化CmXTH28超表达载体T_1果实9个,其平均成熟时期为41天,比对照早熟5天。综上所述,初步研究结果表明CmHsp70和CmXTH28基因均具有促进果实成熟的作用。
【图文】：
在正常情况下表达极少或不表达，而在热激或其他胁迫条件下表达迅速增强，属于诱导SP[61]。根据其在细胞中的定位情况，Hsp70 可以分为 4 个亚族：细胞质 Hsp70、内质网70、线粒体 Hsp70 和叶绿体 Hsp70[62]。对其结构功能了解比较清楚也比较有代表性的有以个成员：HSP70、HSC70、PBP74、GRP78[63]。2 Hsp70 家族的结构特征及主要功能Hsp70 蛋白高度保守，大约由 650 个氨基酸组成，X 光衍射晶体分析表明，Hsp70 的结包括 2 个主要功能结构区域：核酸结合结构域(Nucleotide binding domain, NBD)和底物结构域(Substrate binding domain, SBD)[62,64-65]，即含有 ATP 酶结构域(ATPase domain)的 N其具有 ATPase 酶活性，氨基酸序列高度保守；含多肽结合结构域(Peptide-binding domai-端区域，，其又可以分为 2 个亚区，紧连 ATPase 结构域，是 Hsp70 与多肽底物的结合部该两区域之间由一绞链部分相连（图 1.1）[61]。
图 2.1 两基因靶位点示意图T1：上游编辑位点；T2：下游编辑位点。Figure 2.1 Map of target sites of each geneT1: Upstream editing site; T2: Downstream editing site证有较高的编辑效率，将靶序列的 GC 含量>40%，最好为 50%-70%之间，同时现连续的 T，以及发夹结构的出现。可用 mFOLD 软件对 sgRNA 的二级结构进有二级结构的序列，以提高编辑效率。物接头及通用引物回溶至 5 pmol/L，而编辑引物回溶至 15 pmol/L，分别取引物，90℃反应 10 s 准备好接头，后置于-20℃保存。sgRNA 进行组装，首先验证 BsaI 活性及载体，具体做法为：利用限制性内切酶 sgRNA 的两个中间载体取 200-300 ng pYLCRISPR/Cas9 载体（有两个 BsaI 位点g pYLsgRNA 载体（有三个 BsaI 位点）进行酶切鉴定，反应结束后进行 1%的琼检测，以验证酶切效率。
【学位授予单位】：内蒙古大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S652;Q943.2
本文编号：2655730
【图文】：
在正常情况下表达极少或不表达，而在热激或其他胁迫条件下表达迅速增强，属于诱导SP[61]。根据其在细胞中的定位情况，Hsp70 可以分为 4 个亚族：细胞质 Hsp70、内质网70、线粒体 Hsp70 和叶绿体 Hsp70[62]。对其结构功能了解比较清楚也比较有代表性的有以个成员：HSP70、HSC70、PBP74、GRP78[63]。2 Hsp70 家族的结构特征及主要功能Hsp70 蛋白高度保守，大约由 650 个氨基酸组成，X 光衍射晶体分析表明，Hsp70 的结包括 2 个主要功能结构区域：核酸结合结构域(Nucleotide binding domain, NBD)和底物结构域(Substrate binding domain, SBD)[62,64-65]，即含有 ATP 酶结构域(ATPase domain)的 N其具有 ATPase 酶活性，氨基酸序列高度保守；含多肽结合结构域(Peptide-binding domai-端区域，，其又可以分为 2 个亚区，紧连 ATPase 结构域，是 Hsp70 与多肽底物的结合部该两区域之间由一绞链部分相连（图 1.1）[61]。
图 2.1 两基因靶位点示意图T1：上游编辑位点；T2：下游编辑位点。Figure 2.1 Map of target sites of each geneT1: Upstream editing site; T2: Downstream editing site证有较高的编辑效率，将靶序列的 GC 含量>40%，最好为 50%-70%之间，同时现连续的 T，以及发夹结构的出现。可用 mFOLD 软件对 sgRNA 的二级结构进有二级结构的序列，以提高编辑效率。物接头及通用引物回溶至 5 pmol/L，而编辑引物回溶至 15 pmol/L，分别取引物，90℃反应 10 s 准备好接头，后置于-20℃保存。sgRNA 进行组装，首先验证 BsaI 活性及载体，具体做法为：利用限制性内切酶 sgRNA 的两个中间载体取 200-300 ng pYLCRISPR/Cas9 载体（有两个 BsaI 位点g pYLsgRNA 载体（有三个 BsaI 位点）进行酶切鉴定，反应结束后进行 1%的琼检测，以验证酶切效率。
【学位授予单位】：内蒙古大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S652;Q943.2
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1 张鸿;甜瓜CmHsp70-9及CmXTH28-2基因的克隆及其在果实发育中功能的初步鉴定[D];内蒙古大学;2019年
本文编号：2655730
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