超嗜热古菌PINA蛋白的生化性质和功能及其甲基化修饰研究

发布时间：2020-05-15 14:57

【摘要】：实验室前期从冰岛硫化叶菌(Sulfolobus islandicus REY115A)中发现并鉴定了一种新型ATP酶,命名为SisPINA,它能够在体外驱动Holliday junction DNA(HJ)迁移,与HJ特异性核酸内切酶Hjc具有物理上和功能上的相互作用,并协调HJ加工。结构分析表明ATP的结合和水解会引起SisPINA构象发生变化,促进HJ分支迁移(branch migration)。然而,SisPINA在HJ加工和处理中如何与其它蛋白协同发挥作用以及它参与古菌同源重组修复的具体过程还不太清楚,因此,我们需要更多的生物化学、结构和功能研究来充分了解该蛋白质的性质,并揭示古菌中同源重组修复的机制。为了进一步拓展SisPINA的功能,我们首先通过Pull-down分析和分子筛验证发现SisPINA和SisHjm具有很强的物理相互作用。实验结果还显示SisPINA羧基端II-KH结构域是与其它蛋白相互作用的重要部位,而SisHjm的第五个结构域不是它与SisPINA相互作用的部位。目前已有很多关于古菌蛋白甲基化修饰的报道,其中赖氨酸的甲基化修饰方面的研究较多,如嗜酸热S.acidocaldarius中的铁氧还原蛋白,硫磺矿S.solfataricus中的谷氨酸脱氢酶、β-糖苷酶、核糖体蛋白L11、天冬氨酸转氨酶、Sso7d2和RFC大、小亚基,冰岛硫化叶菌S.islandicus中的Cren7和Sso7d等都发生不同程度的甲基化修饰。甲基化修饰在古菌中广泛存在,暗示甲基化修饰在古菌中具有重要生理作用。我们尝试鉴定SisPINA在细胞内的翻译后修饰。冰岛硫化叶菌本底水平表达的SisPINA的质谱验证结果显示,在正常生理条件下SisPINA在细胞内发生磷酸化和甲基化修饰,甲基化修饰主要发生在羧基端的赖氨酸(K474、K479、K498和K500)。前期证明羧基端参与蛋白间的相互作用,我们验证该区域的修饰是否调控与其它蛋白的相互作用或具有其他功能。过表达赖氨酸位点突变PINA(K474A/K479A/K498A/K500A)菌株生长曲线表明甲基化修饰不影响蛋白的生长速率。差式量热分析(DSC)实验发现SisPINA蛋白甲基化修饰不影响蛋白的热稳定性。通过等温滴定量热法(ITC)定量测定模拟甲基化修饰的SisPINA蛋白(K474M/K479M/K498M/K500M)与其他蛋白结合力时发现滴定曲线很平缓,有可能是蛋白浓度过低导致,但当我们提高蛋白浓度时,发现蛋白会发生沉淀,因此我们需要其他方法来定量测定蛋白间的结合力。体外甲基化反应后质谱鉴定发现,甲基化转移酶aKMT蛋白可以甲基化SisPINA蛋白,但在体外用Pull-down和分子筛分析两者相互作用时,发现两者并没有相互作用,可能是两者在体内只发生功能性的结合。我们利用Pull-down实验来检测SisPINA野生型蛋白和甲基化模拟蛋白与Hjm、RFCs的相互作用时发现,与野生型SisPINA蛋白相比,SisPINA甲基化模拟蛋白失去了与RFCs和Hjm的相互作用,可能初步说明甲基化修饰会抑制蛋白间的相互作用。接着我们将这四个赖氨酸位点突变为丙氨酸,Pull-down实验表明,SisPINA(K474A/K479A/K498A/K500A)和 Hjm(RFCs)也没有相互作用,说明这四个赖氨酸位点是蛋白间相互作用的重要部位,之后为了进一步确定准确的相互作用部位,我们分别纯化了赖氨酸单突变体蛋白,利用Pull-down实验验证单个位点突变对蛋白间相互作用的影响,发现单突变体不影响蛋白间的相互作用,说明四个赖氨酸位点协同影响蛋白间的相互作用。甲基化修饰是否是SisPINA在细胞内行使功能必需的,甲基化修饰对SisPINA细胞内功能的影响还需要进一步的研究。我们分析了广古菌Thermococcus kodakaraensis KOD1基因组编码SisPINA的同源物序列,发现T.kodakaraensis中编码PINA蛋白的序列位于CRISPR序列附近,且CRISPR序列潜在可以形成HJ结构,猜测TkoPINA(Tko 0953)可能参与CRISPR相关功能。虽然实验发现TkoPINA与CRISPR序列具有很强的结合活性,但与其它单链DNA、双链DNA和HJ也有很强的结合活性。接下来我们利用Pull-down检测了 TkoPINA蛋白与邻近蛋白的相互作用,发现TkoPINA蛋白与GTP酶(Tko 0951)具有很强的结合能力,而与膜位点决定蛋白MinD(Tko 0952)、膜形成抑制蛋白Maf(Tko 0954)(两者与细胞分裂有关)无明显相互作用。体外生化实验发现MinD具有内切酶活性,且TkoPINA可以抑制MinD的内切酶活性,但两者在体内的作用机制还不太清楚。
【图文】：

这些连接也可以通过解旋酶－拓扑异构酶复合物逡逑（ＢＬＭ－Ｔｏｐｏｌｌｌａ－ＲＭＩＩ－ＲＭ１２）降解从而产生非交叉产物。总而言之，重组是一逡逑种非常复杂的反应多种酶活性，，可在许多方面进行调节（图１－４）邋［１５１。逡逑５逡逑

螺旋和包装在其表面的反平行（３片。真核１型和原核ＩＩ型ＫＨ结构域都有一个最逡逑小的Ｐ0ｔａ（３核心，具有两个额外的ａ和卩元素位于Ｃ末端（丨型，真核生物）或Ｎ逡逑末端（１１型，原核生物）（图１－１邋ｌａ）邋［８２］。在所有ＫＨ结构域－核酸复合体结构逡逑中，核酸骨架与保守的ＧｘｘＧ相互作用，与最小ＫＨ中心的的螺旋联系起来。四逡逑个核酸碱基朝向蛋白质凹槽的疏水相互作用和氢键主链和侧链结构中从而介导逡逑核碱基识别（图１－ｌｌｂ，邋ｃ）。目前，具有经典ＫＨ折叠但缺乏保守ＧｘｘＧ基序的逡逑１８逡逑
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q936

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 王科云;叶明亮;邹汉法;;蛋白质甲基化修饰的蛋白质组学分析方法新进展[J];色谱;2016年12期

2 郑杰;;组蛋白赖氨酸甲基化修饰与肿瘤[J];生命科学;2008年03期

3 盛伟;马端;;组蛋白赖氨酸甲基化修饰与先天性心脏病研究进展[J];遗传;2010年07期

4 梁琳;卢光t;;组蛋白甲基化的研究进展[J];现代生物医学进展;2009年10期

5 倪健宏;杨永林;白丁平;;乙酰化、甲基化修饰与肌肉发育及分化研究进展[J];新疆农垦科技;2008年06期

6 居玲莎;李仁奇;杨建军;徐建国;;DNA甲基化修饰在学习记忆中的作用[J];临床麻醉学杂志;2015年08期

7 胡济梁;杨焕杰;Jinye Mu;Tiancong Lu;Juli Peng;Xian Deng;孔照胜;鲍时来;曹晓风;左建儒;;一氧化氮通过调控蛋白质甲基化修饰介导植物胁迫反应[J];科学新闻;2018年04期

8 程智逵;过倩萍;伍会健;;组蛋白精氨酸甲基化修饰对基因转录的调控[J];生物化学与生物物理进展;2008年11期

9 肖传乐;Song Zhu;Minghui He;De Chen;Qian Zhang;Ying Chen;Guoliang Yu;Jinbao Liu;Shang-Qian Xie;Feng Luo;Zhe Liang;De-Peng Wang;伯晓晨;谷晓峰;王凯;晏光荣;;人类基因组DNA中的6mA甲基化修饰[J];科学新闻;2019年02期

10 王巍;牛燕媚;傅力;;DNA甲基化修饰与代谢相关疾病的关系及运动干预展望[J];中国运动医学杂志;2012年08期

相关会议论文 前10条

1 刘建钊;;信使RNA m~6A甲基化修饰特异性的研究[A];第十届全国化学生物学学术会议报告摘要集（青年科学家论坛）[C];2017年

2 居玲莎;李仁奇;杨建军;徐建国;;DNA甲基化修饰在学习记忆中的作用[A];中国中西医结合麻醉学会[CSIA]年会暨第二届全国中西医结合麻醉学术研讨会、江苏省中西医结合学会麻醉专业委员会成立大会论文汇编[C];2015年

3 杨运桂;;RNA Methylations:Regulations and Mechanisms[A];第九届全国核糖核酸学术讨论会论文集[C];2016年

4 何志妮;李道传;李妙;张波;肖勇梅;陈雯;;FLT1高甲基化修饰可作为多环芳烃职业暴露监测的生物标志物[A];中国毒理学会第七次全国毒理学大会暨第八届湖北科技论坛论文集[C];2015年

5 金帆;;ART出生子代DNA稳定性及其甲基化修饰改变[A];2014浙江省医学会医学遗传学学术年会论文汇编[C];2014年

6 陈丰;章莉莉;万佳佳;韩倩倩;段文秀;吴疆;葛玉舒;刘丹;;针对组蛋白甲基化修饰基因编码FRET荧光探针的开发与应用[A];第十届全国化学生物学学术会议论文摘要集（墙报）[C];2017年

7 刘建钊;;生物大分子信使RNA m~6A甲基化修饰特异性的研究[A];中国化学会2017全国高分子学术论文报告会摘要集——主题B：生物大分子[C];2017年

8 周雅川;万冕;李飞飞;樊怡;周昕;杜玮;皮彩霞;崔迪新;张斌鹏;孙建勋;郑黎薇;周学东;;组蛋白甲基化修饰调控WNT5A基因在牙间充质细胞分化中的作用机制[A];2017全国口腔生物医学学术年会论文汇编[C];2017年

9 陈国强;李智立;;基于MALDI-MS的峰标签策略:一种能筛选并区分蛋白质天冬氨酸和谷氨酸体外甲基化修饰的方法[A];第十一次中国生物物理学术大会暨第九届全国会员代表大会摘要集[C];2009年

10 何志妮;李道传;陈丽萍;马璐;张爱华;段化伟;郑玉新;肖勇梅;陈雯;;不同环境暴露人群外周血淋巴细胞TRIM36基因甲基化修饰的特点和意义[A];2017环境与公共健康学术会议暨中国环境科学学会环境医学与健康分会、中国毒理学会生化与分子毒理专业委员会2017年年会论文集[C];2017年

相关重要报纸文章 前6条

1 记者 丁佳;中科院植物所 解析果实成熟调控新机制[N];中国科学报;2019年

2 记者 孙国根;触发白血病关键蛋白工作机制被揭示[N];健康报;2014年

3 孙国根;白血病发生关键蛋白工作新机制被发现[N];中国医药报;2014年

4 本报特约撰稿 王丹红;20年磨一剑 打开DNA研究新天地[N];四川科技报;2007年

5 生命学院;杨茂君研究组在《基因与发育》上发文[N];新清华;2014年

6 记者 李鹏;孪生凶手,杀死DNA检测？[N];北京科技报;2012年

相关博士学位论文 前10条

1 刘晓丹;m_2~6A双甲基化修饰及其甲基化机理的结构和功能研究[D];中国科学技术大学;2019年

2 姜玲;组蛋白甲基化修饰对油菜开花的调控和在雄配子体发育中的分布研究[D];湖南农业大学;2018年

3 王晨;靶向蛋白精氨酸甲基转移酶的药物发现、优化与抗肿瘤机制研究[D];中国科学院大学(中国科学院上海药物研究所);2019年

4 党艳丽;宫颈癌DAP-kinase1基因异常甲基化修饰及其逆转的研究[D];第四军医大学;2004年

5 江凌慧;脓毒症患者外周血白细胞中组蛋白甲基化修饰的研究[D];复旦大学;2013年

6 李静;H3K4二甲基化修饰结合蛋白的鉴定及其功能研究[D];华东师范大学;2011年

7 耿鹏宇;精氨酸甲基转移酶PRMT7的自甲基化修饰及其在乳腺癌进程中的作用和机制研究[D];东北师范大学;2017年

8 潘炜松;PRMT1通过对MyoD精氨酸甲基化修饰调控成肌细胞分化[D];北京协和医学院;2010年

9 王居平;TLR4乙酰化/甲基化修饰激活对炎症免疫的调节[D];浙江大学;2011年

10 陈国强;20S蛋白酶体快速分离和异质性研究及蛋白质体外甲基化修饰和行为表征[D];中国协和医科大学;2010年

相关硕士学位论文 前10条

1 方仲佩;基于核磁共振的两种甲基化修饰蛋白检测[D];中国科学院大学(中国科学院武汉物理与数学研究所);2019年

2 韩小云;超嗜热古菌PINA蛋白的生化性质和功能及其甲基化修饰研究[D];山东大学;2019年

3 王绯绯;转录因子YY2的赖氨酸甲基化修饰的功能和分子机制研究[D];厦门大学;2018年

4 陶雪莲;猪肌肉和脂肪组织全转录组m~6A甲基化图谱揭示转录调控功能及差异甲基化修饰模式[D];四川农业大学;2017年

5 廖光红;H3K4甲基化酶SET1A甲基化修饰YAP的机制和生物学功能的研究[D];华东师范大学;2016年

6 麻玉慧;WDR5赖氨酸甲基化修饰及其功能研究[D];东北师范大学;2016年

7 关文月;细胞特异性的DNMT1甲基化修饰对其稳定性的调控[D];华东师范大学;2012年

8 韩化南;组蛋白精氨酸甲基化修饰调控拟南芥芽再生的机制研究[D];山东农业大学;2013年

9 普雪娇;甲基化修饰和位点突变分别对拟南芥SEC24蛋白功能的影响[D];深圳大学;2016年

10 任庆先;胶质瘤细胞中GDNF基因启动子1区甲基化修饰对其基因转录的影响[D];苏州大学;2012年

本文编号：2665217