天蓝色链霉菌调控蛋白SCO3008的功能研究

发布时间：2020-05-16 13:06

【摘要】：链霉菌(Streptomyces)是一种有着复杂生命周期的革兰氏阳性细菌,可以合成多种有生物活性的次生代谢产物。天蓝色链霉菌(Steptomyces coelicolor)是最具代表性的模式菌株,其基因组于2002年完成测序。分析表明,其基因组可编码68对双组份信号转导系统,13种孤儿调控蛋白和17种孤儿传感激酶。孤儿调控蛋白在染色体上单独存在,并且在相邻位置没有与其配对的基因。这些调控蛋白大多在链霉菌应答环境刺激和代谢产物生成调控中扮演重要的角色。本研究对孤儿调控蛋白SC03008在分化发育及次级代谢过程中发挥的调控功能进行了初步研究。选取天蓝色链霉菌(Steptomyces coelicolor)M145基因文库中sco3008阳性克隆22G7,通过PCR-targeting方法在cosmid 22G7中进行sco3008的缺失突变,然后通过大肠杆菌与链霉菌接合转移实现sco3008的突变,并获得突变菌株△3008。选取多种培养基来分析由sco3008基因缺失引起的表型差异,在MS-G、MS-M、R2YE固体培养基上发现,△3008表现出对气生菌丝一定程度的损伤以及放线紫红素(Act)和十一烷基灵菌红素(Red)的过量差生。YBP固体培养基上,△3008表现出更为明显的表型缺陷,整个观察周期内未产生明显的气生菌丝,表现出“光秃”表型;在次生代谢方面,△3008显示出比M145更显著的放线紫红素(Act)及十一烷基灵菌红素(Red)过量产生。为了确定△3008的表型缺陷是由于sco3008的缺失造成的,我们构建了△3008互补菌株,表型分析发现回补菌株在分化发育和次级代谢方面的表型变化都得到了完全的恢复,这说明突变株△3008的表型缺陷是由于sco3008的缺失造成的。我们通过RNA-Seq分析了野生型M145及突变株△3008基因的表达差异,并界定了SC03008在体内调节的基因集群。与M145相比,△3008有135个基因表达量显著上调,包括放线紫红素合成基因簇、十一烷基灵菌红素合成基因簇;引起表达量下调的多达568个基因,包括编码气生菌丝生长和孢子成熟基因如chaplin基因、rodlin基因、bld基因、whi基因、wbl基因、膜蛋白编码基因,以及一些功能未知的结构基因。表明孤儿调控基因sco3008在调节天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)分化发育和次生代谢中起重要的作用。为了寻找SC03008在链霉菌体内直接调控的靶基因,我们构建了SC03008-Flag融合蛋白互补菌株,该菌株能够完全回补.sco3008缺失造成的表型缺陷,而且能够有效表达SC03008-Flag融合蛋白。我们利用该菌株进行了ChIP-Seq试验并辅助ChIP-qPCR和DNA-Pull Down试验成功找到SC03008在体内直接调控的2个靶基因,分别是wblA和sco13 75。表明SC03008对链霉菌分化发育和次生代谢的调控是通过调节这两个基因的表达来实现的。为了进一步探讨调控蛋白SC03008对天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)分化发育和次生代谢的影响,在本研究中,采用外源性的强启动子构建SC03008过表达菌株。表型分析显示该菌株产生的气生菌丝少于野生菌株M145,并且过量产生放线紫红素,这表明孤儿调控蛋白SC03008的调控功能很可能与其蛋白表达量有关,即表达量水平较低时,调控功能是促进气生菌丝的形成、抑制放线紫红素Act产量;表达量水平较高时,则表现为抑制气生菌丝的产生、促进放线紫红素Act过量表达。综上所述,我们可以明确孤儿调控蛋白SC03008在分化发育及次级代谢方面的调控机制,是一个重要的全局性调控因子。
【图文】：

因在染色体上单独存在的称为孤儿基因；除此之外，还存在更为复杂的非典型双逡逑组份系统：以多个传感激酶或多个应答调控蛋白排列成基因簇的形式存在如逡逑图１．２。之外，一些研宄发现还存在“三组份信号转导系统”。逡逑３逡逑

ＲＲ邋ｇｅｎｅｓ逡逑｜逦｜逦Ｎｏｒｔ－ＴＣＳ邋ｇｅｎｅｓ逡逑图１．２双组份信号转导系统基因形式分类逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．２邋Ｇｅｎｅ邋ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ邋ｆｏｒｍ邋ｏｆＴＣＳｓ１＇９１逡逑原核生物双组份系统中的组氨酸感应激酶通常为跨膜蛋白，具有典型的二聚逡逑体膜受体，包括感应域、激酶域、催化域（结合并水解ＡＴＰ）。感应域的功能主逡逑要是识别信号；在检测到信号后，，组氨酸激酶水解ＡＴＰ并在激酶结构域中保守逡逑的组氨酸残基上自身磷酸化；ＡＴＰ结合域含有六个保守的序列，在羧基末端又四逡逑个保守基序：Ｎ、Ｇｌ、Ｆ和Ｇ２，在空间结构上形成“ＡＴＰ结合口袋”，特异性结逡逑合ＡＴＰｌＭ。感应调控蛋白，负责传递组氨酸感应激酶传递来的信号，感应调控蛋逡逑白是胞质蛋白，结构上分为两部分：Ｎ－末端是含有能够接受磷酸基的天冬氨酸残逡逑基的调控区域；Ｃ－末端为效应区域
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q936

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1 王新圆;天蓝色链霉菌调控蛋白SCO3008的功能研究[D];山东大学;2019年

本文编号：2666775