苜蓿CIPK基因的克隆与功能研究
发布时间：2020-05-16 15:41
【摘要】：紫花苜蓿(Medicago sativa.)是在国内大范围种植的牧草,具有产量高,品质好,适应性好等优点。Ca~(2+)是植物逆境胁迫下的主要调控因子,而CBL/CIPK信号调控系统对Ca~(2+)起很大的调控作用。因此本研究利用分子生物学技术对苜蓿CIPK基因进行研究。本研究利用对实验室现存的CIPK基因功能缺失突变体(cipk3、cipk5、cipk11、cipk18、cipk21)进行筛选,将具有高度敏感表型的CIPK3基因列为主要研究的基因。蒺藜苜蓿与紫花苜蓿的高度同源性(99%)且为模式植物,本研究主要研究了蒺藜苜蓿R108的CIPK3基因。利用同源序列比对法获得蒺藜苜蓿CIPK3基因序列,采用生物信息学相关技术对CIPK3基因进行蛋白组学及功能分析;以此为基础,探究CIPK3基因在不同胁迫(高盐胁迫、干旱胁迫及ABA胁迫)下的表达水平,本试验采用了实时荧光定量(qRT-PCR)技术来进行分析;构建蒺藜苜蓿R108 CIPK3基因的功能过表达载体2×35 Sp CAMBIA1300-CIPK3,通过农杆菌介导法转化拟南芥成功获得了CIPK3基因过表达的植株,随后运用转基因拟南芥来进行初步功能的研究。主要研究结果如下:1.蒺藜苜蓿CIPK3基因的cDNA全长为1293 bp,编码430个氨基酸残基。信号肽预测结果显示CIPK3基因编码蛋白内不含有信号肽,存在两个跨膜结构域,主要定位于细胞质,推测其为在细胞质中行使功能的非分泌蛋白,并且与鹰嘴豆、大豆、百脉根、豇豆等豆科植物亲缘关系较近,而与拟南芥、苹果、玉米、小麦、水稻等植物的亲缘关系较远。2.蒺藜苜蓿CIPK3基因在植株的根和叶片中均有一定量的表达,且在叶片中的相对表达量是在根中的3.84倍。当受到高盐胁迫、干旱胁迫及ABA胁迫时,CIPK3基因在植株的各部位的表达水平都表现出一定量的上调,并且表达水平会根据胁迫处理时间的不同发生相应的变化。在受到ABA胁迫时,CIPK3基因的相对表达水平的上升幅度最大,高盐胁迫其次,干旱胁迫时变化幅度最小。3.通过筛选得到转CIPK3基因拟南芥的T3代植株后,对其进行高盐胁迫处理,以野生型为对照观察表型,验证CIPK3基因在胁迫环境下的功能。结果发现,CIPK3基因对种子萌发有积极作用,且植株的根长存在显著差异,初步推测其通过维持植株体内正常的离子平衡来维持植物正常生长。综上所述,本研究最终验证了蒺藜苜蓿CIPK3在植物受到非生物胁迫时能显著地提高植物的抗逆性,为后期研究抗逆性强的紫花苜蓿打下了基础。
【图文】：
图 1-1 CBL/CIPK 复合体在调节细胞离子稳态中的作用模型。f calcineurin B-like (CBL) CBLinteracting protein kinase (CIPK) funcellular ion homeostasis白家族的结构现了与动物 CNB( B subunit of calcineurin)、 NCS( neurona序列同源性的蛋白家族，由于该蛋白家族是未知的，为了名为CBL ( Zhu et al.1998; Kudla et al.1999)。CBL的结构：哑铃状的由一个较短连接域连接起来的两个球形区域，是域。任意一个CBL蛋白上都存在4个EF手型结构，其能与边EF手型结构上，各自存在一个α螺旋，并且1(X)，3(Y)，Z)这几个位置上的氨基酸是结合Ca2+必需的( Kudla et al.2 EF手型位点数目的不同（一个、两个或不包含典型位点分为三组( Batisticand.2009; Sánchez-Barrena et al.2013)。除
图 1-1 CBL/CIPK 复合体在调节细胞离子稳态中的作用模型。Fig.1-1 Model of calcineurin B-like (CBL) CBLinteracting protein kinase (CIPK) function in regulatingcellular ion homeostasis1.1.1 CBL 蛋白家族的结构植物中发现了与动物 CNB( B subunit of calcineurin)、 NCS( neuronal calcium sensor)白具有高度序列同源性的蛋白家族，由于该蛋白家族是未知的，为了方便研究，，研人员将其命名为CBL ( Zhu et al.1998; Kudla et al.1999)。CBL的结构：CBL蛋白的C端在一个类似哑铃状的由一个较短连接域连接起来的两个球形区域，是主要跟CIPK蛋的结合的区域。任意一个CBL蛋白上都存在4个EF手型结构，其能与Ca2+高度亲和，图2所示，两边EF手型结构上，各自存在一个α螺旋，并且1(X)，3(Y)，5(Z)，7(－Y)，(－X)和12(－Z)这几个位置上的氨基酸是结合Ca2+必需的( Kudla et al.2009; Lewit etl.2000)。根据 EF手型位点数目的不同（一个、两个或不包含典型位点）可以将CBL白大致可以分为三组( Batisticand.2009; Sánchez-Barrena et al.2013)。除此之外，CBL白还有一个N端序列，该序列的主要功能是决定 CBL/ CIPK复合体的亚细胞定位。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S541;Q943.2
本文编号：2666959
【图文】：
图 1-1 CBL/CIPK 复合体在调节细胞离子稳态中的作用模型。f calcineurin B-like (CBL) CBLinteracting protein kinase (CIPK) funcellular ion homeostasis白家族的结构现了与动物 CNB( B subunit of calcineurin)、 NCS( neurona序列同源性的蛋白家族，由于该蛋白家族是未知的，为了名为CBL ( Zhu et al.1998; Kudla et al.1999)。CBL的结构：哑铃状的由一个较短连接域连接起来的两个球形区域，是域。任意一个CBL蛋白上都存在4个EF手型结构，其能与边EF手型结构上，各自存在一个α螺旋，并且1(X)，3(Y)，Z)这几个位置上的氨基酸是结合Ca2+必需的( Kudla et al.2 EF手型位点数目的不同（一个、两个或不包含典型位点分为三组( Batisticand.2009; Sánchez-Barrena et al.2013)。除
图 1-1 CBL/CIPK 复合体在调节细胞离子稳态中的作用模型。Fig.1-1 Model of calcineurin B-like (CBL) CBLinteracting protein kinase (CIPK) function in regulatingcellular ion homeostasis1.1.1 CBL 蛋白家族的结构植物中发现了与动物 CNB( B subunit of calcineurin)、 NCS( neuronal calcium sensor)白具有高度序列同源性的蛋白家族，由于该蛋白家族是未知的，为了方便研究，，研人员将其命名为CBL ( Zhu et al.1998; Kudla et al.1999)。CBL的结构：CBL蛋白的C端在一个类似哑铃状的由一个较短连接域连接起来的两个球形区域，是主要跟CIPK蛋的结合的区域。任意一个CBL蛋白上都存在4个EF手型结构，其能与Ca2+高度亲和，图2所示，两边EF手型结构上，各自存在一个α螺旋，并且1(X)，3(Y)，5(Z)，7(－Y)，(－X)和12(－Z)这几个位置上的氨基酸是结合Ca2+必需的( Kudla et al.2009; Lewit etl.2000)。根据 EF手型位点数目的不同（一个、两个或不包含典型位点）可以将CBL白大致可以分为三组( Batisticand.2009; Sánchez-Barrena et al.2013)。除此之外，CBL白还有一个N端序列，该序列的主要功能是决定 CBL/ CIPK复合体的亚细胞定位。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S541;Q943.2
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本文编号：2666959
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