日本七鳃鳗nucleolin-like基因的克隆及其在先天性免疫中的功能初探

发布时间：2020-05-30 21:55

【摘要】：七鳃鳗是迄今为止在海洋生物中发现的最原始的无颌类脊椎动物之一。其化石距今约3.6亿年,因此七鳃鳗被称为“活化石”。由于其在进化地位上的特殊性,长久以来,七鳃鳗都具有很大的研究价值。Nucleolin是真核细胞核仁中一种重要的蛋白质,具有多种重要的细胞功能,在细胞增殖、死亡、免疫,尤其在rRNA合成和免疫中扮演重要的角色。本论文首次在日本七鳃鳗(Lampetra japonica)中发现了nucleolin(核仁素,C23)的同源物(nucleolin-like),对其进行了研究,初步取得了如下研究成果。首先,本论文成功从日本七鳃鳗的白细胞cDNA文库中克隆出长度为1941bp,编码为646个氨基酸的nucleolin-like全长基因。经过同源序列比对发现,该基因和其他脊椎动物nucleolin具有约50%的同源性。同时,构建了不同物种nucleolin的进化树,发现nucleolin-like的进化位置介于无脊椎动物和鱼类之间,与七鳃鳗在物种进化中的位置一致。其次,将nucleolin-like C端片段进行克隆并构建到pET-28a载体中,获得原核表达重组质粒。在E.coli BL21中表达原核蛋白,并纯化。用纯化蛋白免疫新西兰大白兔,制备得到anti-nucleolin-like多克隆抗体,并验证了抗体的效价和特异性。通过real-time PCR、western blot和流式细胞术分析手段对nucleolin-like在日本七鳃鳗体内组织分布以及表达情况进行检测。结果表明,nucleolin-like在日本七鳃鳗白细胞和所有组织的mRNA水平均有表达,而在白细胞、鳃、肾和髓组织中的表达量更为明显。最后,以Poly(I:C)刺激日本七鳃鳗白细胞,白细胞中nucleolin-like的mRNA水平和蛋白表达水平在Poly(I:C)的刺激下均有提高。同时发现,Poly(I:C)的刺激能够使nucleolin-like由细胞核转移到细胞质中。以上结果表明,nucleolin-like在七鳃鳗的先天性免疫应答中可能扮演着与人源nucleolin相似的重要角色。综上所述,本论文首次在日本七鳃鳗中发现并克隆得到了nucleolin-like的全长基因;成功制备了anti-nucleolin-like的多克隆抗体;探明了其在日本七鳃鳗各组织中的分布;对Poly(I:C)刺激后nucleolin-like在细胞中的表达与转位情况进行了初探。为进一步研究nucleolin-like在七鳃鳗先天性免疫中的作用奠定了基础。
【图文】：

日本七鳃鳗 Nucleolin-like基因的克隆及其在先天性免疫中的功能初探本七鳃鳗的白细胞总 RNA七鳃鳗的白细胞中提取总 RNA，用分光光度计检测其0 为 1.92，处于 1.8-2.0 范围内，说明 RNA 纯度较好。根据计算μg/mL，取 2 μL RNA 溶液进行电泳检测。结果显示，白细胞 R带较为清楚（图 2.1），证明 RNA 的提取效果较好。

图 2.2 日本七鳃鳗 nucleolin-like EST 序列 PCR 电泳图M: DL 5000 Marker; 1: Nucleolin-like EST 序列Fig. 2.2 PCR electropherogram of nucleolin-like EST sequence of L. japonicM: DL 5000 Marker; 1: The nucleolin-like EST sequenceucleolin-like EST 序列与 T 载体连接，，并转化到 DH5α中，之后进粒（图 2.3），提质粒（图 2.4）后送往生物公司进行测序。
【学位授予单位】：辽宁师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q78;Q95

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