糖苷水解酶GH97家族成员PspAG97A的催化机制分析

发布时间：2024-07-06 01:18

　　糖苷水解酶GH97家族是一个特殊的家族,同时拥有反转和保留两种催化类型成员,其两种催化类型如何分化目前还不清楚。对GH97家族成员PspAG97A的催化机制进行分析,通过高效液相色谱法检测水解产物异头物的构型,根据在不同酶反应时间所检测到的α-葡萄糖与β-葡萄糖的比例变化,证明PspAG97A执行反转催化机制。通过结构分析与定点突变等方法尝试对PspAG97A的催化类型进行改造,将PspAG97A与同一家族成员BtGH97b(保留型)活性中心进行叠加比较,仿照保留类型的催化装置对相关位点G407、E377及E456进行单点突变和联合突变。结果显示突变酶活力相比野生型显著下降,并分析了相关位点的作用。研究加深了对PspAG97A催化机制的认识,为GH97家族两种催化类型进化关系的研究奠定基础。

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【部分图文】：

图1PspAG97A结构示意图

使用Pymol软件对PspAG97A与GH97家族中执行保留类型催化机制的α-半乳糖苷水解酶BtGH97b进行结构比对分析,仿照保留类型的催化装置,将PspAG97A催化中心的Gly407突变为对应于BtGH97b中的Asp415,使其作为亲核体。而Glu480作为广义酸碱,先后....

图2重组酶与突变酶的SDS-PAGE检测分析

α-葡萄糖苷酶PspAG97A以外切的方式水解底物非还原末端,断开α-1,4-糖苷键释放出一分子葡萄糖。通过HPLC方法检测了PspAG97A降解pNPαG降解产物的异头碳形式。如图3所示,在反应初始阶段,酶催化底物pNPαG水解产生β-D-葡萄糖。随着酶反应时间的增加,α型:....

图3PspAG97A水解产物异头碳构型分析

图2重组酶与突变酶的SDS-PAGE检测分析2.4PspAG97A与突变酶的酶活力分析

图4PspAG97A与催化类型转变相关突变体的酶活力大小

以pNPαG作为底物,重组酶PspAG97A作为对照,测定突变酶水解底物的活力大小,并运用统计软件SPSS17.0对数据进行多重比较分析。从图4可以看出,突变酶的比活力与重组酶相比降低了100倍以上,差异显著(P<0.05)。而突变酶之间相比,差异不显著(P>0.05)。这说明....

本文编号：4001839