重组大肠杆菌分泌表达鼠源羧肽酶B及其培养基优化

发布时间：2024-07-05 02:49

　　为了简化纯化步骤,节约生产成本,笔者构建了能够胞外分泌鼠羧肽酶原B(proCPB)的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-OmpA-proCPB,并进行发酵优化。结果表明:在信号肽OmpA的引导下,proCPB成功分泌至胞外,激活后的羧肽酶B(carboxypeptidase B,CPB)比酶活为131.22 U/mg。通过单因素及正交试验对发酵工艺进行优化,得出最佳培养基组合为甘油7 g/L、复合氮源15 g/L、MgSO₄ 4 mmol/L、山梨醇0.3 mol/L、NaCl 10 g/L;最佳发酵条件为诱导温度30℃,诱导时间24 h。优化后,胞外proCPB的相对表达量为6.35(优化前的相对表达量为1)。首次实现了鼠羧肽酶原B在大肠杆菌中的胞外分泌表达,为羧肽酶B的工业化直接应用提供了一定的技术支持。

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【部分图文】：

图1重组表达质粒pET28a-OmpA-proCPB双酶切验证

2.1重组表达质粒的构建将构建得到的重组表达质粒pET28a-OmpA-proCPB用EcoRⅠ和HindⅢ酶切验证,结果如图1所示。由图1可见,大小为5724和1313bp的条带,分别与pET28a线性化载体和OmpA-proCPB-6*His融合片段大小一致,且测序结....

图2重组菌BL21(DE3)/pET28a-OmpA-proCPB

将重组菌BL21(DE3)/pET28a-OmpA-proCPB进行摇瓶发酵,诱导表达30h后取发酵液进行离心,所得上清液即为粗酶液。经镍柱分离纯化,并使用SDS-PAGE进行分析,结果如图2所示。由图2可知,条带2为单一条带,大小约为4.6×104,条带大小与重组蛋白理论分子....

图3胰蛋白酶最佳酶解时间的确定

羧肽酶原B是羧肽酶B的酶原形式,胰蛋白酶通过在Arg95处切除前导肽可将羧肽酶原B激活,得到有活性的羧肽酶B。胰蛋白酶的酶解条件对羧肽酶B的酶活性至关重要。笔者在1∶50质量比的条件下,对胰蛋白酶的酶解时间进行优化,发现酶解时间过短,羧肽酶原B不能被完全酶解,只能得到部分羧肽酶....

图4纯化后CPB的SDS-PAGE

透析后的proCPB酶液经胰蛋白酶酶解2h后,立即加入0.1mmol/L的苯甲基磺酰氟(PMSF)终止反应,并进行镍柱分离纯化,对洗脱液进行SDS-PAGE分析,结果如图4所示。由图4可知,通过试验得到单一目的条带,大小约为3.5×104,经测定比酶活为131.22U/mg....

本文编号：4000927