Ⅲ-A型CRISPR-Cas系统蛋白核酸复合物的表达纯化及功能的初步研究

发布时间：2020-06-02 12:20

【摘要】：目前已经被开发的基因编辑工具按先后顺序依次为:锌指核酸内切酶、类转录激活因子效应物核酸酶以及成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关基因系统(CRISPR-Cas systems),它们有各自的优缺点及适用范围。其中CRISPRCas9系统因其使用简单便捷、成本低等优势,是当前使用最多的基因编辑工具。但同时它也存在不足之处:其一,适用范围受原间隔邻近基序(PAM)严格限制;其二,脱靶率比较高。所以现在很多学者立志于解决有关这两方面的问题。本课题即针对III-A型CRISPR-Cas系统相关核酸-蛋白复合物进行研究,其优势主要在于它是CRISPR-Cas系统中唯一既能切割DNA又能切割RNA的,并且该系统不受PAM识别范围的限制。该系统是由多个Csm蛋白以及CRISPR RNA(crRNA)组成的复合物,但目前其结构和功能方面的信息还有很多未知。本课题主要利用多种层析方法纯化高纯度野生型Csm-crRNA复合物研究其结构,根据冷冻电镜技术解析出来的结构方面的信息对Cas10蛋白某些位点进行突变。通过纯化突变型Csm-crRNA复合物和转录回收含有部分错配的ssRNA研究复合物的脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶功能及二者之间的关系,期望能为后续研究该系统的功能机制和开发新型CRIPSPR-Cas系统基因编辑工具提供一定的支撑。
【图文】：

3图 1-1 CRISPR-Cas 系统适应性免疫的三个阶段[11]应阶段，外源核酸上的原间隔序列被选择、加工并整合到了对抗外源核酸的感染“记忆”，，随后 CRISPR 基因座转pre-crRNA），然后在重复序列处对前 crRNA 进一步剪切后是干扰阶段，当外源遗传物质入侵后在 crRNA 的引导的原间隔序列，破坏了外源遗传物质的完整性[11]。

哈尔滨工业大学理学硕士学位论文尽管它们缺乏由基因 cas1 和 cas2 组成的保守型适应模块，并且 cas10 基因又存在序列差异，但它们的整体遗传组成与 III-A 和 III-B 亚型类似，Makarova 等人认为 III-C 和 III-D 亚型具有与 III-A 和 III-B 亚型相似的干扰机制[1]。
【学位授予单位】：哈尔滨工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q78

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本文编号：2693145