高山倭蛙冬眠的生理生化特征及分子机制

发布时间：2020-06-02 14:13

【摘要】：高山倭蛙(Nanorana parkeri)分布于青藏高原南部,是世界上现存分布最高的两栖动物,栖息地海拔在2850-5100米之间。青藏高原素有世界屋脊‖之称,具有寒冷和低氧等独特的环境特征。在长期进化过程中世居高原的动物产生了一系列包括形态结构、行为、生理以及分子水平上的适应性特征。冬眠作为一种常见的冬季生存策略,使生物体能够从长期的寒冷和饥饿中存活,在动物的高海拔适应中至关重要。迄今为止,尚未见到关于青藏高原两栖动物冬眠的系统研究。本论文以高山倭蛙为研究对象,采用生理生化、分子生物学的方法比较分析了高山倭蛙冬眠期和活动期的形态、代谢率、心率、线粒体呼吸速率、代谢物、代谢酶活性及基因表达量、氧化应激、氧化损伤和抗氧化保护能力的季节性差异;利用转录组和代谢组学技术,探究了高山倭蛙冬眠的转录和代谢调控机理;通过对冬眠期高山倭蛙结冰耐受能力的研究,结合代谢组学方法,揭示高山倭蛙低温耐受的分子机制。实验结果表明,冬眠期高山倭蛙的体重、身体质量指数和肝体指数显著增加。与活动期相比,冬眠期高山倭蛙在8°C和20°C下的静止代谢率分别下降约76%和66%;在冬眠期肝脏中,线粒体状态III的呼吸速率在8°C和20°C分别下降约76%和65%,状态IV的呼吸速率在8°C和20°C下分别下降44%和56%;在冬眠期肌肉组织中,线粒体状态III的呼吸速率在20°C下降46%,状态IV的呼吸速率不存在季节性差异。冬眠期肝脏和肌肉组织中细胞色素C氧化酶(CCO)活性显著降低,编码CCO的基因COX1、COX2、COX3的mRNA水平也显著下降。以上结果表明高山倭蛙在冬眠期发生了动物整体和线粒体水平上的代谢抑制,这对节省能量和维持生命至关重要。然而,肝脏和肌肉组织中乳酸脱氢酶(LDH)活性在冬眠期显著增加,编码LDH的基因LDH(A)的mRNA水平也显著上升,表明高山倭蛙通过上调乳酸脱氢酶来补偿冬眠期间低温对无氧代谢的影响。此外,肝脏和肌肉组织中高水平的糖原为高山倭蛙成功越冬提供大量的能源储备。通过比较活动期和冬眠期高山倭蛙心脏、脑、肝脏和肌肉组织中氧化应激、氧化损伤水平和抗氧化能力,发现高山倭蛙肝脏、心脏和肌肉组织中总谷胱甘肽和还原型谷胱甘肽含量在冬眠期显著降低;肝脏、心脏和脑组织中氧化型和还原型谷胱甘肽的比例在冬眠期显著升高。与活动期相比,上述测定组织中硫代巴比妥酸反应物的含量在冬眠期显著增加;除肝脏外,其它组织中的脂质过氧化物水平显著上升;肝脏和脑中羰基蛋白的含量也显著增加。此外,肝脏中抗氧化酶的活性在冬眠期显著降低,上述测定组织中总抗氧化能力也显著下降。这些结果表明高山倭蛙的冬眠伴随氧化应激,脂质和蛋白质的氧化损伤也明显增加,但抗氧化保护能力却显著降低。通过对活动期和冬眠期的肝脏、肌肉组织进行比较转录组分析,在肝脏中,共筛选出4387个差异基因,其中冬眠期下调的基因有1992个(45%),上调基因有2395个(55%)。在肌肉组织中,共筛选出2434个差异基因,其中冬眠期下调基因有1425个(59%),上调基因有1009个(41%)。GO富集结果显示,肝脏中上调的基因(NOX1、TNFRSF9、CD28、BTK、IRF5和IRF8等)在免疫应答相关过程(GO:0001817、GO:0002764、GO:0002521)中显著富集,这可能是免疫系统对冬季低温影响的一种补偿,有助于在冬眠过程中维持正常的免疫防御功能,对高山倭蛙的成功越冬是有利的。肌肉组织中与收缩功能相关的基因(LOC108794414、MYLIP、TNNT1和TNNT2等)在冬眠期显著上调,能够有效地防止肌肉组织在冬眠期间的废用性萎缩,并可对出眠后的活动(如觅食、繁殖等)提供帮助。肝脏和肌肉组织中下调的基因在能量代谢过程(GO:0006631和GO:1901605等)显著富集,而且KEGG富集结果显示,肝脏中参与碳代谢(npr01200)、脂肪酸代谢(npr01212)、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢(npr00260)、甘油磷酸脂代谢(npr00564)等过程的基因表达下调,这在mRNA水平上说明了高山倭蛙在冬眠期处于代谢抑制状态。转录组结果中COX1、COX2、COX3等表达量的下调与酶活性变化、实时定量PCR实验的结果一致。代谢相关基因的表达下调,有助于降低冬眠过程中的能量消耗。此外,肝脏中编码抗氧化保护酶的基因(SOD2、GSTZ1、GSTCD等)在冬眠期显著下调,这与酶活性的结果吻合,表明高山倭蛙的抗氧化保护能力在冬眠期减弱。采用GC-MS代谢组学比较分析了活动期和冬眠期肝脏、肌肉组织中的代谢物差异,在肝脏中筛选并鉴定出35种差异代谢物,其中冬眠期上调的有13种,下调的有22种。在肌肉组织中筛选并鉴定出22种差异代谢物,其中冬眠期上调的有9种,下调的有13种。肝脏和肌肉组织中甘油磷脂代谢(npr00564)途径中的代谢物在冬眠期上调;而氨基酸合成和代谢途径中的代谢物在冬眠期间显著下调,这些途径包括苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成(npr00400)、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成(npr00290)、苯丙氨酸代谢(npr00360)、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢(npr00260)等,这很可能与高山倭蛙在冬眠期不进食以及体内蛋白质的降解过程被抑制有关。此外,肝脏中乳酸显著积累,表明冬眠期高山倭蛙肝脏中无氧代谢活动剧烈,高浓度的乳酸也可以作为冬眠过程中的抗冻保护剂。肌肉组织中麦芽糖、果糖和肌醇的浓度升高,这可能与低温保护、渗透平衡调节等作用有关。对冬眠期的高山倭蛙进行结冰处理后发现,与其它已发表的结冰耐受物种相比,冬眠的高山倭蛙仅表现出较弱的结冰耐受能力,肌肉组织在结冰处理后发生脱水,有助于降低体内的冰含量。对结冰处理前后的肝脏、肌肉组织进行代谢组学比较分析,在肝脏中共鉴定出33种差异代谢物,其中结冰处理后上调的代谢物有29种,下调的代谢物有4种;在肌肉组织中共鉴定出36种差异代谢物,其中结冰处理后上调的代谢物有25种,下调的代谢物有11种。结冰显著影响肝脏和肌肉组织中丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢(npr00250)、精氨酸和脯氨酸代谢(npr00330)、谷氨酰胺和谷氨酸代谢(npr00471)等通路。结冰处理后,鸟氨酸、松三糖、麦芽三糖等含量显著积累,可能参与低温保护过程;不饱和脂肪酸含量升高,可以使膜在低温下保持流动性,有助于高山倭蛙耐受结冰。此外,次黄嘌呤和8-羟基-2-脱氧鸟嘌呤含量显著升高,表明结冰诱导高山倭蛙处于氧化应激状态。综上所述,本文系统地研究了高山倭蛙冬眠的生理生化特征及分子调控机制,研究结果有助于阐明与冬眠相关的代谢抑制的机理,填补青藏高原两栖动物冬眠研究的空白,进一步丰富和完善冬眠生物学研究的理论体系,为高山倭蛙和青藏高原的生态环境的保护提供参考。通过对高山倭蛙结冰耐受的研究,为青藏高原两栖动物低温适应的研究奠定基础,为低温医学的研究和发展提供参考。
【图文】：

高山,两栖动物,地理分布

海拔 2850-5100 米的地方（图 1-1），被认为是世界上迄今所知海拔分布最高栖动物[115, 116]。高山倭蛙主要生活在沼泽地、湖泊或水塘附近，成年高山倭晴天的时候喜欢隐匿于水草丛中或小水塘边的洞穴内，阴雨天则在水塘边或草丛中活动，其繁殖季节通常为 5-7 月，产卵量小且繁殖力较低[117, 118]。因居于高原极端环境，并能顽强地生活和繁衍后代，素有高原草根‖之称[119]前，对高山倭蛙的研究主要集中在系统发生关系和地理分布、生活史和形态学子生态学、高海拔适应和免疫学等方面。

高山,栖息地,环境,肌肉组织

眠期）（图 2-1）。采样期间，使用电子 micro-dataloggers（Thermochron iButtons，Maxim Integrated，达拉斯）记录高山倭蛙洞穴中的环境温度，随机选取 7 个洞穴，每 10 min 记录一次，连续记录 3 天；使用手持式电子测温计（TM6801b；漳州市威华电子有限公司，漳州，中国）测定高山倭蛙的泄殖腔温度（即体温）。在采样地附近，将高山倭蛙立即断头处死，取心脏、大脑、肝脏、肌肉组织并速冻于液氮中，带回实验室（兰州大学），转移到-80 °C 超低温冰箱中保存，然后用于氧化应激、氧化损伤和抗氧化保护酶活性测定实验；取血浆、肝脏和肌肉组织用于测定代谢物含量；另取肝脏和肌肉组织用于代谢酶活性及基因表达量、转录组测序和代谢组检测。
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q958

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