水稻黑条矮缩病毒（RBSDV）的多层次翻译调控
发布时间：2020-06-03 09:05
【摘要】：水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV)是呼肠孤病毒科(Reoviridae)斐济病毒属(Fijivirus)第二组成员,引起水稻黑条矮缩病、玉米粗缩病等。RBSDV基因组包括十条双链RNA(dsRNA),5'端具有帽子结构(m7GPPPN),3'末端没有poly(A)尾结构,共编码13种蛋白;其中S5、S7、S9各自编码两个蛋白,属于双顺反子RNA,其余链是单顺反子RNA,各编码一个蛋白。RBSDV基因组的10条双链RNA的5'和3'末端各自存在十分保守的序列,且紧邻5'和3'端的序列存在潜在的碱基互补配对。本文研究RBSDV单顺反子RNA的非编码区对翻译的调控作用及机制;RBSDV双顺反子RNA的蛋白表达特性以及调控第二个蛋白表达的顺式作用元件。利用萤火虫荧光素酶(Fluc)报告基因载体和定点突变分析,探究RBSDV单顺反子RNA S3和S10的的非编码区对翻译的调控作用及机制。结果表明:(1)S3和S10的5'UTR在有无帽子时均可以正向调控报告基因Fluc的翻译,表现核糖体内部进入位点(IRES)活性;且5'UTR的基因组间保守序列及邻近序列均参与IRES活性;(2)对应的3'UTR则抑制5'UTR对翻译的正调控效应,其分子基础是5'UTR和3'UTR之间的RNA-RNA互作;且该RNA-RNA互作也抑制帽子依赖型翻译的效率。利用~(35)S标记的体外翻译体系同步分析RBSDV基因组双顺反子S7与S9分别编码的两个蛋白的表达情况及比例;然后利用萤火虫荧光素酶(Fluc)报告基因载体和定点突变分析初步定位第二个蛋白翻译调控的顺式作用元件。结果表明:(1)S7和S9各自编码的2个蛋白都可以从基因组表达,暗示这2个双顺反子RNA的第二个蛋白的表达模式是内部起始。S7编码的第二个蛋白P7b的表达量约为第一个蛋白P7a的4.7%;而S9编码的第二个蛋白P9b的表达量约为第一个蛋白P9a的18.8%;(2)S9编码的P9a与P9b的基因间隔区(IGR)中存在2个小的ORF;由于这2个小ORF消失时P9b的蛋白表达量提高约73.4%,表明2个小ORF的存在降低了P9b的蛋白表达效率;(3)S7和S9的IGR具备弱IRES活性;且相应的3'UTR可以协同提高IGR的IRES活性。综合两部分的研究结果,发现3'UTR在单顺反子RNA的翻译调控中起抑制作用,而在双顺反子的第二个蛋白的翻译调控中起促进作用。暗示3'UTR可能是双顺反子RNA调控2个蛋白表达比例的关键区段。
【图文】：
1.1.4 基因组结构及功能RBSDV 的基因组由 10 条双链 RNA（dsRNA）组成，含有 13 个开放阅读框（ORF）。按照其基因组片段由大到小的顺序依次命名为 S1-S10（图 1），其中 S1 片段最大，，大小为 4501bp，S10 最小，片段大小为 1801bp（Zhang et al.，2001；Wang et al.，2003）。据基因组序列分析结果显示，RBSDV的10条基因组片段末端含有两个高度保守的序列，均为5'-AAGTTTTTT……CAGCTA(G)T(C/A)T(C)GTC-3'，并且紧邻保守序列的是7-11bp的反向重复序列（Zhang et al.，2001；Wang et al.，2003；Wei et al.，2009；Deng et al.，2012），可潜在介导 5'和 3'末端的远距离互作，但具体功能尚未报道。
合载体pF-RB-S3-5U和pF-RB-S10-5U（构建策略见附表2），其各自的体外转录产物（F-RB-S3-5U和F-RB-S10-5U）进行体外翻译反应。测定报告基因表达量，显示F-RB-S3-5U和F-RB-S10-5U的体外翻译效率均为空载体F（FLuc）的5倍左右（图2-A&B），而分别含有S3的1-104位核苷酸序列和S10的1-111位核苷酸序列的体外转录产物F-RB-S3-(1-104)、F-RB-S10-(1-111)，与只含有相应5'UTR的体外转录物（F-RB-S3-5U和F-RB-S10-5U）相比，无明显提高翻译效率（图2-A&B）。结果表明，RBSDV S3和S10的5'UTR含有不依赖帽子翻译的正调控序列元件，即具备潜在的IRES活性。此外，含有5'帽子结构的空载体Cap-F相对于不加帽的空载体F（FLuc），其翻译效率大约提高36倍（图2-A&B）；含有5'帽子结构的体外转录产物Cap-F-RB-S3-5U和Cap-F-RB-S10-5U
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S432.41
本文编号：2694600
【图文】：
1.1.4 基因组结构及功能RBSDV 的基因组由 10 条双链 RNA（dsRNA）组成，含有 13 个开放阅读框（ORF）。按照其基因组片段由大到小的顺序依次命名为 S1-S10（图 1），其中 S1 片段最大，，大小为 4501bp，S10 最小，片段大小为 1801bp（Zhang et al.，2001；Wang et al.，2003）。据基因组序列分析结果显示，RBSDV的10条基因组片段末端含有两个高度保守的序列，均为5'-AAGTTTTTT……CAGCTA(G)T(C/A)T(C)GTC-3'，并且紧邻保守序列的是7-11bp的反向重复序列（Zhang et al.，2001；Wang et al.，2003；Wei et al.，2009；Deng et al.，2012），可潜在介导 5'和 3'末端的远距离互作，但具体功能尚未报道。
合载体pF-RB-S3-5U和pF-RB-S10-5U（构建策略见附表2），其各自的体外转录产物（F-RB-S3-5U和F-RB-S10-5U）进行体外翻译反应。测定报告基因表达量，显示F-RB-S3-5U和F-RB-S10-5U的体外翻译效率均为空载体F（FLuc）的5倍左右（图2-A&B），而分别含有S3的1-104位核苷酸序列和S10的1-111位核苷酸序列的体外转录产物F-RB-S3-(1-104)、F-RB-S10-(1-111)，与只含有相应5'UTR的体外转录物（F-RB-S3-5U和F-RB-S10-5U）相比，无明显提高翻译效率（图2-A&B）。结果表明，RBSDV S3和S10的5'UTR含有不依赖帽子翻译的正调控序列元件，即具备潜在的IRES活性。此外，含有5'帽子结构的空载体Cap-F相对于不加帽的空载体F（FLuc），其翻译效率大约提高36倍（图2-A&B）；含有5'帽子结构的体外转录产物Cap-F-RB-S3-5U和Cap-F-RB-S10-5U
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S432.41
【参考文献】
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本文编号：2694600
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