橡胶草小橡胶粒子蛋白基因及其启动子的克隆与功能分析

发布时间：2020-06-03 08:33

【摘要】：目的:天然橡胶在国民经济以及科技领域中占有重要地位,橡胶草(Taraxacum kok-saghyz Rodin)根中所产橡胶质量与巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)的橡胶相当,由于其生育周期较短、易于进行遗传转化等优点,是研究天然橡胶产胶机理的理想模式植物。小橡胶粒子蛋白(Small Rubber Particle Protein,SRPP)是橡胶颗粒膜蛋白中重要的组成成分,在橡胶凝固和橡胶产量中均起到一定作用,因此研究橡胶草SRPP基因功能,鉴定控制SRPP基因表达的调控元件,为研究天然橡胶生物合成的分子作用机制奠定理论基础。方法:本研究以橡胶草为实验材料,利用荧光定量法分析TkREF/SRPPs基因家族的表达模式;以TkSRPP3基因为研究对象,分析其时空表达以及原核表达模式;利用转基因技术获得转TkSRPP3基因的橡胶草植株;在橡胶草基因组数据的基础上,克隆PTkSRPP3启动子,利用基因工程技术构建P0/P1/P2/P3/P4::GUS植物表达载体,通过组织化学染色法分析缺失启动子活性;激素及伤害处理P0/P1/P2/P3/P4::GUS转基因烟草,利用GUS酶活测定法检测GUS报告基因表达量的变化,分析启动子缺失元件对外界环境变化的影响。结果:(1)TkREF/SRPPs基因家族经茉莉酸甲酯(MeJA)处理后,TkREF/SRPPs家族中TkSRPP1和TkSRPP3的表达量显著上调;经脱落酸(ABA)处理后,TkREF/SRPPs家族中TkSRPP3的表达量显著上调;(2)克隆得到TkSRPP3基因,开放阅读框为690bp,编码229个氨基酸,TkSRPP3蛋白分子质量24.431kDa,属于酸性蛋白,具有REF保守结构域,是REF/SRPPs家族成员之一;系统进化树分析表明TkSRPP3与短角蒲公英TbSRPP3同源性较高;时空表达分析结果表明,TkSRPP3基因在六月龄的橡胶草根部组织中表达量最高;原核表达分析TkSRPP蛋白大小为24.3kDa,在浓度为1mM IPTG诱导表达6h为最佳诱导条件,可获得大量蛋白;构建pCAMBIA2300-TkSRPP3植物表达载体,成功获得5株转TkSRPP3基因橡胶草;(3)克隆得到PTkSRPP3启动子,序列长度为2188bp;序列分析表明启动子具有基础的启动子特征元件以外,还包含关于组织特异表达元件和响应光、激素、伤害、热等顺式作用元件;构建启动子融合GUS报告基因的植物表达载体,组织化学染色证明启动子具有启动活性,不具有组织特异性;构建P0(-2188bp)/P1(-1592bp)/P2(-1274bp)/P3(-934bp)/P4(-450bp)启动子缺失片段融合GUS报告基因的植物表达载体,GUS染色分析显示启动子缺失片段均有活性,缺失启动子活性随着片段的截短而活性减弱;(4)利用ABA、SA(水杨酸)、MeJA和伤害处理稳定表达GUS基因的烟草植株,GUS酶活表达量显示:含有ABA响应元件的P0(-2188bp)/P1(-1592bp)/P2(-1274bp)受ABA处理正调控;含有JA响应元件的P2(-1274bp)受MeJA处理正调控;含有SA响应元件的P1(-1592bp)/P2(-1274bp)受SA处理正调控;含有伤害响应元件的P3(-934bp)受伤害处理正调控。结论:(1)TkREF/SRPPs基因家族响应MeJA和ABA的表达模式各不相同,其中TkSRPP3基因同时受到两类激素的强烈诱导表达;(2)TkSRPP3基因的生物信息学分析表明TkSRPP3属于REF/SRPPs家族,且无跨膜结构域;TkSRPP3基因的时空表达分析显示六月龄橡胶草根部组织中TkSRPP3的表达量最高;(3)PTkSRPP3启动子具有启动活性,不具有组织表达特异性;PTkSRPP3缺失启动子中含有ABA响应元件的P0(-2188bp)/P1(-1592bp)/P2(-1274bp)受ABA处理正调控;含有JA响应元件的P2(-1274bp)受MeJA处理正调控;含有SA响应元件的P1(-1592bp)/P2(-1274bp)受SA处理正调控;含有伤害响应元件的P3(-934bp)受伤害处理正调控。
【图文】：

橡胶颗粒蛋白的亚细胞相互作用和定位模型（引自BrownDetal.,2017）

橡胶草小橡胶粒子蛋白基因及其启动子的克隆与功能分析

TkREF/SRPPs家族定量分析
【学位授予单位】：石河子大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q943.2

【参考文献】