黑曲霉菌株柠檬酸合成酶基因的敲除及功能分析

发布时间：2024-09-17 17:34

　　 【背景】柠檬酸合成酶是碳代谢途径的中心酶,其在三羧酸循环(tricarboxylic acid cycle,TCA)、氨基酸合成和乙醛酸循环中发挥着重要作用,是柠檬酸合成的关键酶。本论文所选用的是一株高产柠檬酸的黑曲霉菌株CGMCC10142。【目的】克隆柠檬酸合成酶关键基因,构建柠檬酸合成酶的敲除菌株并鉴定其在黑曲霉菌株高产柠檬酸过程中的功能及影响。【方法】采用根癌农杆菌转化方法并利用同源重组原理,采用抗性筛选和致死型反向筛选的双重筛选方法获得正确敲除株。对转化子在不同碳源下的生长情况进行观察并对柠檬酸发酵过程中菌丝球变化和产酸量进行分析,最后通过荧光定量PCR分析柠檬酸合成酶基因对黑曲霉积累柠檬酸的影响,及其对主要代谢途径中重要酶相关基因和其他的表达量的影响。【结果】以柠檬酸高产菌株黑曲霉CGMCC10142为出发菌,构建一株遗传稳定的柠檬酸合成酶敲除的菌株T1-2。结果发现该菌株在以葡萄糖为碳源的培养基上生长缓慢并且产生孢子量减少。通过摇瓶发酵产酸实验,结果表明敲除菌在84 h产酸量为64.3 g/L,相对于出发菌的98.7g/L降低了34.85%。通过荧光定量PCR发现柠檬酸合...

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【部分图文】：

图14个柠檬酸合成酶的氨基酸序列比对

基于对CGMCC10142基因组的分析，该菌株具有4个编码柠檬酸合成酶的基因。4个柠檬酸合成酶的氨基酸序列比对如图1所示，差异较大，但依然具有活性位点和乙酰辅酶A的结合位点。分别将黑曲霉4个柠檬酸合成酶的氨基酸序列与不同物种的柠檬酸合成酶比较发现，第4个柠檬酸合成酶(An09g0....

图2柠檬酸合成酶cs基因的克隆

图14个柠檬酸合成酶的氨基酸序列比对2.2cs基因缺失菌株的构建

图3不同物种的柠檬酸合成酶的氨基酸序列比对

由于自身基因的缺失和外源基因的随机插入都会导致黑曲霉的生长形态发生改变(图6)。从菌落形态可以看出，两株菌以葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、麦芽糖为单一碳源时菌落较大，以阿拉伯糖、乳糖、乙酸钠、丙酸钠为唯一碳源时的菌落较小。从产孢情况来看，黑曲霉CGMCC10142在葡萄糖和半乳糖为唯....

图4对不同物种柠檬酸合成酶构建的系统发育树

图3不同物种的柠檬酸合成酶的氨基酸序列比对图5敲除株质粒构建过程和阳性转化子的验证

本文编号：4005799