斑马鱼尾动脉经内皮造血转化产生造血干细胞及前体细胞

发布时间：2020-06-08 04:46

【摘要】：造血干细胞(HSC)是血液系统各细胞组分的共同祖细胞,它通过不断增殖和有序分化,形成了整个血液组分,同时通过持续的自我更新维持着造血干细胞和整个血液谱系的稳态。造血干细胞形成、维持、增殖以及分化的缺陷会导致多种血液系统及免疫系统的疾病,如白血病、贫血、类风湿和红斑狼疮等。因此,造血干细胞的正常形成对于机体的健康起着至关重要的作用。与此同时,治疗血液系统疾病的一个重要方法是造血干细胞移植,对于造血干细胞的形成和调控机制需深入认知,体外诱导造血干细胞的生成及扩增是实现移植治疗的先决条件。所以,关于造血干细胞的相关研究,尤其是造血干细胞的起源过程、谱系分化和细胞形成的分子调控机制的研究一直以来都是生命科学和医学领域的热点。通过对小鼠等模式动物进行深入的研究,研究者发现原始造血发生在卵黄囊,这些血液细胞短暂存在并主要分化为原始红系和髓系祖细胞。随着胚胎的发育定向造血出现在AGM中,因为最早检测到造血干细胞的出现而被认为是造血干细胞产生的位置,其中一部分位于主动脉腹侧壁的血管内皮细胞会特化为生血内皮细胞并在特定的胚胎发育时间窗,通过内皮-造血转化过程(EHT)分化为造血干细胞。近年来通过检测造血干细胞的标记分子,谱系追踪和移植等一系列实验,科研工作者发现胚胎期小鼠的脑血管也能够原位产生造血干细胞,且这群造血干细胞的发生几乎与AGM来源同步。在胚胎阶段除了AGM区的生血内皮细胞外,其他部位的胚胎细胞能够重建成体小鼠的造血系统,这促使科研工作者怀疑在胚胎发育的特定时间段是否还存在着其他的原位产生造血干细胞的器官或组织。在对造血干细胞的发生过程和调控机制的认知中,斑马鱼扮演了不可替代的重要角色。通过对斑马鱼活体实时成像研究者直接证实了造血干细胞通过内皮-造血转化过程的方式源于背侧主动脉(DA)腹侧壁的生血内皮细胞,后会进一步迁移到后部血岛组织(caudal hematopoietic tissue,CHT)进行增殖和分化,最终这些造血干细胞会迁移到胸腺和肾脏(与高等动物的骨髓功能类似),为整个斑马鱼一生血液系统的维持提供着源源不断的支持。CHT的功能和小鼠的胎肝相似,造血干细胞迁移到CHT后与微环境的各组成细胞之间相互作用的动态过程,是造血干细胞进一步增殖和分化的区域。但是CHT是否可以原位产生造血干细胞是从没有被研究的全新课题。本课题首先通过活体实时成像,发现在斑马鱼CHT的尾部主动脉(caudal dorsal artery,CDA)腹侧壁一些kdrl-EGFP+细胞会出现DA区类似的EHT过程,这些细胞最终会被标记HSPCs的CD41-GFP、cmyb-GFP和runx1-GFP所标记,偶尔可以观察到kdrl-EGFP+细胞出芽后会分裂。我们利用共聚焦405激发波长对转基因品系Tg(kdrl:Dendra2)进行光转化,标记部分尾部动脉腹侧壁,之后可看到造血区域如CHT,胸腺和肾脏都存在被标记的细胞。对12个胚胎斑马鱼CDA进行活体实时成像观察,其中大约在DA的EHT过程之后60 hpf(hours post fertilization)左右,CDA与尾部静脉分开,CHT的EHT过程开始,一直持续到156 hpf。CDA大部分的EHT过程发生在60 hpf-84 hpf,随时间的推移,EHT频率慢慢下降。不同时间段60-84,84-108,108-132,132-156和156-180 hpf EHT的频率(不同时间段四个体节的出芽频率)分别是5.60±0.68,3.40±0.81,1.50±0.40,0.80±0.58和0.0±0.0。在统计的15小时中,每四个体节CDA出芽频率(3.57±0.57)低于DA出芽频率(5.86±0.26)。因此,CDA在时空上独立于DA,通过EHT过程产生HSPCs。为了进一步探索CDA产生的HSPCs,我们利用Tg(CD41:GFP;coro1a:Ds Red),Tg(kdrl:mem Cherry;coro1a:Kaede)追踪DA和CDA刚产生的HSPCs的行为特征。刚产生的细胞中含有coro1a-Ds Red信号和CD41-GFP弱信号,并且coro1a-Kaede信号也在刚出芽的kdrl-mem Cherry+细胞中表达,这说明我们可以用coro1a-Kaede光转化来标记DA和CDA刚产生的HSPCs。结果显示,CDA出芽产生的coro1a-Kaede细胞大约30%-40%很快分裂成两个子细胞,12小时内会进行第二次分裂,随后一些细胞会进入血管和血液循环,另一部分细胞会保持原位置进行第三次分裂。其中,偶尔能观察到一些细胞进入血液循环后会再次进入CHT微环境。CDA产生的细胞在细胞行为学上很像HSPCs的行为,形态上成球形分裂成前体细胞,体积分裂后会变小。相比之下,CDA产生的coro1a-Kaede+细胞一大半经过一次分裂会产生髓样的前体细胞,细胞形态呈变形虫形态而且变大。经过10个小时,这些髓样前体细胞会分裂成3-4个子细胞,迁移到CHT微环境中呈现分支装表型,一些细胞会随血管迁出CHT并迁移至皮肤,呈现典型的髓系细胞的行为。大约有2%-5%被标记的细胞在出芽时会破碎死掉。通过光转化标记DA和CDA出芽的coro1a-Kaede+细胞,经过60小时的追踪,这些细胞行为学的追踪表明CDA产生的HSPCs存在着异质性。由于DA和CDA产生的HSPCs在时空上和迁移倾向上有所不同,我们探讨其中潜在的调控分子。Runx1对于DA的EHT过程来说是必不可少的转录因子,那Runx1是如何影响CDA区的EHT过程的呢?我们利用斑马鱼突变体runx1w84x/w84xTg(kdrl:EGFP),发现CDA无法完成EHT过程,有些细胞会有出芽的趋势,但是最后都收缩回去。这说明CDA和DA一样,EHT过程都需要转录因此Runx1来调控。在造血过程中,血流对血管剪切应力促进了造血干细胞的产生。我们利用无血流的tnnt2aswu77斑马鱼突变体,发现CDA的EHT过程被抑制,而且大部分HSPCs向CDA血管内侧出芽,而DA向腹侧出芽产生的HSPCs。上述结果表明,从DA到CDA连续发生的EHT过程,为整个动脉都有造血能力提供了证据。为了进一步探究动脉不同时间段对成体斑马鱼造血的贡献情况,我们利用Tg(kdrl:Cre ERT2;actb2:lox P-Ds Red-stop-lox P-EGFP)s928转基因系统,在五个时间点20 hpf,60 hpf,72 hpf,120 hpf和9 dpf(days post fertilization)对斑马鱼胚胎进行4-OHT(4-Hydroxytamoxifen)处理,并检测出4-OHT只诱导血管及血液细胞Cre重组酶活性。对4个月零后的成年斑马鱼的不同组织区域进行切片免疫荧光染色。利用GFP和Lcp1两个抗体共同标记出早期胚胎来源的造血细胞,20 hpf处理组中,成年斑马鱼造血组织中GFP阳性细胞占Lcp1+细胞的比例最高,肾脏中占比76%,胸腺中占比89%,随着处理时间的推移,GFP+Lcp1+细胞比例下降。相比于20 hpf处理组,60 hpf处理组中GFP+Lcp1+细胞在胸腺比例下降的幅度要比肾脏中的轻微一些,这暗示着这一时段动脉造血对成年胸腺淋巴细胞贡献较大。与此同时,大多数成年斑马鱼中脑部小胶质细胞由kdrl+细胞分化而来,这支持了定向造血来源地小胶质细胞的观点。之后,我们在Tg(kdrl:Cre ERT2;coro1a:lox P-Ds Redx-stop-lox P-GFP)s928转基因系统里用了相同处理方法,得出了上述相似的结论。因此,随着时间的推移,kdrl+动脉内皮细胞通过EHT过程对成年造血谱系的贡献能力逐渐减弱。根据我们的研究表明,在斑马鱼中位于CHT区的CDA作为新发现的造血位点,与AGM区的DA类似,具有通过EHT过程产生HSPCs的能力,并且产生的HSPCs迁移至不同造血组织器官。我们的发现扩展了斑马鱼造血发育过程的理论研究。
【图文】：

谱系,模式生物,斑马鱼

图 1.1 斑马鱼作为模式生物的优势[18]。斑马鱼是现存物种中种理想的模式生物。像果蝇样，斑马鱼胚胎透明而且胚胎产量大，可以用于快速的筛选工作和实验操作。斑马鱼和老鼠样，具有脊椎动物相应的解剖学、生理学和肿瘤生物学。Figure 1.1 Strengths of the zebrafish system[18]. The zebrafish is an ideal complement to existinggenetic systems. Like flies, the transparent embryos are produced in large numbers and are accessible for rapidscreening and experimental manipulation. Like mice, zebrafish have vertebrate anatomy, physiology, and tumorbiology.1.2 脊椎动物造血系统的发育过程在胚胎造血的研究过程中，研究者经过了数十年的努力使用了多种不同的模式生物，其中包括鸡类、两栖类、鱼类以及哺乳类[19, 20]。脊椎动物的整个造血过程尽管存在些差异，但在定程度上是保守的。这些研究促使研究者归纳了脊椎动物胚胎造血作用的的过程。在所有脊椎动物中，具有完整血液谱系的建立都是在原始造血（primitive hematopoiesis）和定向造血（definitive hematopoiesis）发育过程中进行的，这些造血过程发生在不同的解剖位置[21]。在非洲爪蟾血液

谱系,时空调控,造血功能,脊椎动物

西南大学博士学位论文细胞出现在腹侧血岛（ventral blood islands, VBIs），而定向造血来源于背侧中胚层（dorsal lateral plate mesoderm, DLP mesoderm）[22]。在哺乳动物中，原始造血主要发生在胚胎外卵黄囊中,细胞会分化成原始红细胞和巨噬细胞[23]。在发育的后期，永久造血在主动脉-性腺-中肾（aorta-gonad-mesonephros, AGM）产生多潜能的造血干细胞，可以分化成各个血液谱系，之后迁入胎肝进行增殖，，而在成体最终造血发生在骨髓中[24]。（图 1.2）。
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q462

【参考文献】