冬眠不同时期达乌尔黄鼠不同组织氧化应激水平和抗氧化防御机制的比较研究

发布时间：2020-06-09 05:44

【摘要】：非冬眠动物(大鼠、小鼠、人类等)在机械去负荷、禁食、缺血-再灌注等应激状态下,体内氧化与抗氧化作用失衡,出现氧化应激,长时间的氧化应激会使机体出现氧化损伤。而冬眠动物在“冬眠-阵间觉醒”循环中伴随着“缺血-再灌注”、禁食和机械去负荷等多种应激挑战,但是在其出眠后并未表现出明显的氧化损伤迹象,对冬眠期多重应激条件诱导的氧化应激表现出极强的防御能力。因此,探讨冬眠动物冬眠不同时期不同组织中氧化应激水平变化及其调控机制是目前动物生理学领域有关动物对极端或特殊环境生理适应机制研究的一大热点。核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2[NF-E2]-related factor 2,Nrf2)/Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein 1,Keap1)信号通路是公认的抗氧化损伤的重要通路。当体内产生大量的活性氧(reactive oxygen species,ROS)时,Nrf2与Keap1解离而被激活,激活后的Nrf2易位至细胞核,与小Maf(small musculoaponeurotic fibrosarcoma)蛋白形成异二聚体并与抗氧化应答元件(antioxident response element,ARE)结合,启动下游多种抗氧化酶表达上调,从而清除过多的ROS,保护机体免受氧化损伤。因此,本文将以冬眠哺乳动物达乌尔黄鼠(Spermophilus dauricus)为研究对象,检测冬眠不同时期不同组织中氧化应激水平(过氧化氢和丙二醛)的变化,以及主要的抗氧化酶(超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶)的蛋白表达、酶活性及各组织的总抗氧化能力,就Nrf2/Keap1信号通路对冬眠动物抗氧化防御的调控机制进行探究;另外,与废用条件下大鼠骨骼肌萎缩程度、氧化应激水平和抗氧化防御能力进行比较,探究冬眠动物和非冬眠动物骨骼肌在废用条件下氧化应激和肌萎缩的关系。本论文由三部分组成。第一部分:冬眠对达乌尔黄鼠不同组织中氧化应激水平和抗氧化防御能力的影响。过氧化氢(H_2O_2)是ROS的一种,能直接反映氧化应激水平;丙二醛(MDA)是脂质过氧化的标志物,可间接反映氧化应激水平。本部分研究首先对心脏、肝脏、脑、肾脏和血浆的氧化应激水平进行了检测,结果显示,与夏季活跃组相比,心脏和脑组织在冬眠阵晚期组中H_2O_2浓度显著增加;MDA浓度在所有组织的阵间觉醒组和冬眠阵早期组均显著降低,但是在脑组织的冬眠阵晚期组中显著增加。出眠组所有组织中H_2O_2和MDA浓度均恢复至夏季组水平。这些结果表明,冬眠动物各组织具有维持氧化还原稳态的能力。进一步对抗氧化酶的表达进行了测定,结果显示,在冬眠-阵间觉醒周期中,心脏中超氧化物歧化酶2(SOD2)蛋白水平和肝脏中过氧化氢酶(CAT)蛋白水平一直维持高水平表达;SOD1和谷胱甘肽过氧化物酶1(GPx1)蛋白水平在所有组织的阵间觉醒和冬眠阵早期组均显著升高;各种抗氧化酶的活性在所有组织的阵间觉醒和冬眠阵早期组中均高于冬眠阵晚期组;但是GPx活性在血浆的整个冬眠-阵间觉醒周期中都维持低活性。这些结果表明,在阵间觉醒期间,上调的抗氧化酶可能及时清除了各组织中由于缺血缺氧再灌注产生的过多的ROS。Nrf2/Keap1信号通路相关指标的结果显示,p-Nrf2(磷酸化状态)的表达在所有组织的阵间觉醒组降低,但在冬眠阵晚期组显著增加,尤其是在肝脏组织中。综合上述结果,我们推测,各组织中冬眠阵晚期组中增加的ROS可能通过激活Nrf2/Keap1抗氧化信号通路,上调下游多种抗氧化酶的表达及时清除过多的ROS,使其在阵间觉醒期维持较低的ROS水平,从而保护机体在冬眠-阵间觉醒周期中免受氧化损伤。第二部分:冬眠达乌尔黄鼠不同时期不同类型骨骼肌中氧化应激水平和抗氧化防御能力的研究。本部分研究选取不同类型的骨骼肌(慢缩肌:比目鱼肌;快缩肌:趾长伸肌;混合肌:腓肠肌),对其氧化-抗氧化水平及其调控机制进行了研究。结果显示,与夏季组相比,趾长伸肌和腓肠肌中,H_2O_2含量在冬眠前和冬眠阵晚期组中显著降低;MDA水平在趾长伸肌和腓肠肌的整个冬眠-阵间觉醒周期中均显著降低,在比目鱼肌的阵间觉醒和冬眠阵早期组显著下降,但是在其冬眠阵晚期组相比阵间觉醒和冬眠阵早期组显著升高;出眠时H_2O_2和MDA浓度在三种肌肉中均恢复至夏季组水平。抗氧化酶的结果显示,比目鱼肌中CAT和GPx1以及腓肠肌中SOD2的蛋白表达在整个冬眠季均维持较高表达水平;趾长伸肌中,SOD2蛋白表达在阵间觉醒和出眠组显著升高,CAT和GPx1蛋白表达在冬眠中(包括冬眠阵早期组和冬眠阵晚期组)显著升高。另外,三种肌肉组织中,多种抗氧化酶的活性在阵间觉醒组和冬眠阵早期组均不同程度的高于冬眠阵晚期组,CAT酶活性在三种肌肉的整个冬眠季均维持高活性。对Nrf2/Keap1信号通路的研究结果显示,比目鱼肌和趾长伸肌中Nrf2和p-Nrf2蛋白表达在整个冬眠季均显著升高,在腓肠肌的冬眠前、阵间觉醒和冬眠阵早期组显著升高。综合上述结果,我们推测,达乌尔黄鼠骨骼肌在冬眠期多重氧化应激条件下,Nrf2/Keap1抗氧化信号通路的激活可能通过上调多种抗氧化酶的表达及时清除了冬眠阵循环中骨骼肌中产生的过多的ROS,使其在整个冬眠期都能维持较低的ROS水平,保护骨骼肌免受氧化损伤。第三部分:对后肢去负荷大鼠和冬眠不活动达乌尔黄鼠不同类型骨骼肌氧化应激水平和抗氧化防御能力以及肌萎缩程度的比较研究。结果显示,与对照组相比,后肢去负荷14天后,大鼠比目鱼肌和趾长伸肌肌重、肌重-体重比和肌纤维横截面积均显著下降。但是,冬眠组黄鼠(不活动两个月)的这几项指标与夏季组相比均没有出现显著变化。对氧化应激水平的检测结果显示,后肢去负荷组大鼠比目鱼肌和趾长伸肌中H_2O_2水平与对照组相比均显著增加,比目鱼肌中MDA水平也显著增加;但是冬眠不活动组黄鼠与夏季组相比,骨骼肌中氧化应激水平在比目鱼肌中没有显著升高,在趾长伸肌中显著下降。后肢去负荷组大鼠比目鱼肌中SOD2、CAT和GPx1蛋白表达均显著下降,但是SOD1蛋白表达显著升高;趾长伸肌中GPx1蛋白表达也显著下降。但是冬眠不活动组黄鼠骨骼肌中SODs蛋白表达维持正常水平,CAT和GPx1蛋白水平显著增加。Nrf2和p-Nrf2蛋白水平在后肢去负荷大鼠比目鱼肌中没有出现显著变化,但在趾长伸肌中显著降低;冬眠不活动黄鼠骨骼肌中Nrf2和p-Nrf2蛋白水平均显著升高。综合上述结果,大鼠在废用条件下,骨骼肌中Nrf2/Keap1抗氧化信号通路被抑制,下游抗氧化酶表达下调,骨骼肌中氧化应激水平升高,因此,我们推测后肢去负荷导致骨骼肌氧化应激水平升高,抗氧化防御能力减弱,可能是导致废用性肌萎缩的重要机制之一。黄鼠在冬眠不活动期间,骨骼肌中Nrf2/Keap1抗氧化信号通路被激活,抗氧化酶表达上调,骨骼肌中ROS维持生理水平,因此,我们推测,冬眠动物在低代谢状态和骨骼肌废用状态下,抗氧化防御能力增强可能是防止冬眠不活动引起的废用性肌萎缩的重要机制。总之,在废用条件下,非冬眠动物和冬眠动物骨骼肌中氧化应激水平和Nrf2介导的抗氧化信号通路的表现明显不同,可能是其肌萎缩程度不同的一个重要原因。综上所述,本研究对达乌尔黄鼠冬眠不同时期不同组织中氧化应激水平、抗氧化防御能力及其调控机制等方面进行了较系统的研究,结果显示,冬眠黄鼠不同组织在冬眠阵晚期组中ROS水平有不同程度上升,但是出眠时均恢复至夏季组水平,表明冬眠达乌尔黄鼠在多重应激条件下,具有维持氧化还原稳态的能力。其次,心脏和脑组织在冬眠阵晚期组中ROS水平显著高于夏季活跃组,表明不同组织对氧化应激具有不同的敏感性。第三,多种抗氧化酶的变化模式具有组织特异性。比如CAT蛋白在肝脏组织的整个冬眠季维持较高水平表达,但是在脑组织中并没有显著变化;GPx1和CAT蛋白表达在比目鱼肌整个冬眠季均显著升高,但是在腓肠肌中没有显著变化。第四,对废用条件下的冬眠黄鼠和后肢去负荷大鼠骨骼肌萎缩程度和氧化应激水平及抗氧化调控的比较研究显示,后肢去负荷组大鼠比目鱼肌和趾长伸肌肌肉萎缩明显,ROS水平显著升高,多种抗氧化酶的表达显著下降,从而表明,后肢去负荷导致骨骼肌氧化应激水平升高,抗氧化防御能力减弱,可能是诱导废用性肌萎缩的重要机制之一;但是冬眠不活动组黄鼠骨骼肌并未出现明显萎缩,且氧化应激水平维持稳定状态,多种抗氧化酶出现高表达,从而表明,冬眠动物在低代谢和废用状态下抗氧化防御能力的增强可能是防止冬眠不活动引起的废用性肌肉萎缩的重要机制。以上研究不仅为我们了解冬眠黄鼠对特殊生态环境的适应机制提供了新视角,也将为与自由基相关疾病的治疗提供理论依据和新的思路。
【图文】：

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3图 1.1 哺乳动物冬眠阵示意图。A：冬眠期间体温的波动变化(Carey et al., 2003; 尹秋媛, 2016)。横坐标代表时间（月份），冬眠时期是从 9 月中旬至次年 4 月；纵坐标代表体温变化。summer active：夏季活跃；hibernation season：冬眠季；IBA：interbout arousal，阵间觉醒。下图为冬眠-阵间觉醒循环（torpor-interbout arousal）的放大图。EN：entrance，进入冬眠；ET：early torpor，冬眠早期；LT：late torpor，，冬眠晚期；AR：arousing，正在觉醒；IBA：interbout arousal，阵间觉醒。B：冬眠哺乳动物的生活史示意图

线粒体电子传递链

其氧化程度超出氧化物的清除能力，氧化系统和抗氧化系统失衡，从而引起的应激反应。细胞中 ROS 主要包括超氧阴离子（O2-·）、羟基自由基（OH·）、过氧化氢（H2O2）和脂质过氧化物（LOOH）等。细胞中很多生理生化过程都会产生 ROS，根据其产生的途径主要分为以下三类(尹秋媛, 2016; 魏艳红等, 2018)：线粒体电子传递是 ROS 产生的最主要途径。人和动物体内在细胞呼吸和能量代谢过程中时刻发生着有氧氧化，分子氧经线粒体电子传递链传递被还原成水，产生ATP。然而电子在经线粒体电子传递链复合体Ⅰ（complex Ⅰ；NADH 脱氢酶复合体，NADH ubiquinone oxidoreductase）和复合体Ⅲ（complexⅢ；细胞色素 c 还原酶复合体，ubiquinone-cytochrome c oxidase）传递过程中极易发生逃逸，与分子氧作用生成诸如 O2-·，OH·和 H2O2等形式的 ROS(Halliwell et al., 1994; Raha et al., 2000; Turrens2003; Murphy 2009)（图 1.2）。在生物体所消耗的氧气中，大约有 1-2%的氧气产生O2-·和 H2O2。
【学位授予单位】：西北大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q418

【参考文献】