一株新的高效尼古丁降解菌的分离鉴定、降解条件优化及代谢机制研究

发布时间：2020-06-09 04:00

【摘要】：尼古丁(Nicotine)具有高毒性,可透过生物膜,化学结构稳定,并且是致癌物质烟草特有亚硝胺(TSNAs)的重要前体物,存在于环境中不易降解,严重污染环境。由于其特殊的水溶性,能够与水以任意比例互溶,对人类生活及生态环境是一个极大的威胁。针对降解高毒、高危害的尼古丁微生物种类较少的实际情况,筛选出一株新的具有高尼古丁降解活性的菌株,探究其降解特性;研究了该菌的降解过程,对其降解条件进行中心响应面优化;通过全基因组测序,分析并确定尼古丁相关基因簇,初步构建ZUC-3尼古丁代谢途径,并对降解关键基因进行功能鉴定。旨在为尼古丁的生物降解相关领域及降解机制的研究提供新的微生物资源和理论依据,研究结果表明:从烟草种植大田土壤分离纯化得到一株具有高尼古丁降解能力的菌株,对其形态学、生理生化特征、16S rRNA基因序列同源性进行了分析鉴定,探究了不同条件下尼古丁降解特性并对其动态降解过程进行了HPLC分析。经鉴定命名为寡养单胞菌Stenotrophomonas sp.ZUC-3,单因素试验结果显示其适宜的降解条件为:温度30℃、起始pH 7.0、接种量10%、培养转速180 r/min,此条件下尼古丁降解率可达到91.53%,HPLC分析显示ZUC-3降解尼古丁过程的动态变化及其高效性。在寡养单胞菌Stenotrophomonas sp.ZUC-3降解尼古丁的Box-Behnken中心响应面优化试验中,添加适量的蛋白胨和NH_4NO_3作为氮源,补充少量的葡萄糖和无机盐,通过PB(Plackett-Burman)试验筛选出对尼古丁降解率影响最显著的三个因素是:温度、时间和搅拌转速。在PB试验结果的基础上,下一步进行最陡爬坡试验设计,由PB试验结果设定爬坡方向与步长,逼近最优区域,得到中心点为:温度37℃,时间32 h,搅拌转速150 r/min,以此为中心点设计Box-Benhnken响应面优化试验,构建优化模型得到最佳条件为:温度30.13℃,时间35.41 h、搅拌转速183.32 r/min,尼古丁降解率理论值为98.34%,并以此条件进行实际降解试验,得到实际尼古丁降解率为99.13%,拟合度达到99.20%,相比优化前尼古丁降解率显著提高。对高效尼古丁降解菌Stenotrophomonas sp.ZUC-3进行全基因组测序及分析,基因组组装共获得90个Contigs,ZUC-3基因组大小为6.08 Mb,共得到5519条CDS序列,tRNA数量为74。通过与已知尼古丁降解相关基因的BLAST比对,预测ZUC-3尼古丁降解相关基因的功能,ZUC-3尼古丁相关基因主要位于Contig3上,绘制出ZUC-3尼古丁降解基因簇,初步构建ZUC-3菌株尼古丁代谢途径。通过qRT-PCR测定ZUC-3降解途径上9个降解基因的表达水平,结果表明,当尼古丁存在时,9个降解基因的表达均显著上调。对ZUC-3中降解关键基因hspB进行分子克隆和功能验证,通过PCR扩增获得hspB基因,以pET 22b为载体,构建重组质粒pET 22b-hspB,转化大肠杆菌BL 21(DE3)进行异源表达,采用SDS-PAGE进行表达验证和检测,并对Hsp-B酶活进行测定。构建得到重组质粒pET22b-hspB并成功表达HspB蛋白,其分子量为43.97 kDa,通过试验检测其表达形式为包涵体,酶促反应结果表明HspB蛋白具有较高的6-羟基-3-琥珀酰吡啶单加氧酶活性,明确了HspB的生物学功能和活性。
【图文】：

图 1.1 尼古丁 R/S 构型化学结构式的危害及毒性作为中枢神经兴奋剂的一种,吸食后可以使人产生心理和成瘾性物质。成年人一次吸入 50-60 mg 的尼古丁即可导尼古丁,可痹抑心脏[13]、抑制中枢神经系统。而且还会使稠度增加、心脏的供血量减缓、产生心绞痛,严重时能引

2 一株新的尼古丁降解菌的分离鉴定及降解特性与分析丁降解菌 ZUC-3 的分离及对尼古丁降解作用古丁为唯一碳氮源的尼古丁培养基，经过初筛与复筛，从湖南省大田土壤样品中分离得到 1 株具有高活性尼古丁降解能力将 ZUC-3 以 5 %的接种量接入尼古丁培养基中，30℃、180 r/min 后，测定发酵液中尼古丁浓度及吸收光谱，结果如图 2.1 所示： 259 nm 存在明显的吸收峰，当接入 ZUC-3 菌株发酵 48 h 后，明 ZUC-3 具有尼古丁降解能力。而且发酵液颜色在降解过程中：初期没有发生颜色变化，当培养至 12 h 左右发酵液颜色开始增加颜色逐渐变深呈墨绿色，24 h 左右墨绿色开始褪去，发酵液，这与目前已报道的微生物降解尼古丁过程中的发酵液颜色变化尼古丁降解过程中生成的中间产物可能不同。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：X592;X172

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本文编号：2704130