ATS1异位表达对拟南芥甘油脂合成及磷胁迫响应的影响

发布时间：2020-06-10 21:56

【摘要】：磷(phosphorus)是植物生存所必须的营养元素,细胞内1/3的有机磷都以磷脂的形式储存。当遭受磷胁迫时,植物细胞会将细胞膜上的磷脂替换为糖脂,这种脂质重塑(lipid remodeling)的过程需要大量糖脂的参与,目前还尚不清楚甘油脂从头合成途径是否涉及其中。拟南芥质体3-磷酸甘油酰基转移酶(ATS1)是甘油脂原核合成途径中催化3-磷酸甘油第一步酰化反应的关键酶,它以质体内的脂酰-ACP为底物。酶学分析发现,ATS1也可以利用细胞质中的脂酰-CoA为底物催化3-磷酸甘油的酰化反应。由于ATS1是一个氨基端带有转运肽的可溶性蛋白,目前还尚不清楚其是否可以参与质体外甘油脂的真核合成途径。本研究通过将ATS1在拟南芥细胞质中表达,探究ATS1异位表达与质体外甘油脂合成途径的联系,初步探讨增强甘油脂合成对拟南芥磷胁迫响应的影响,主要实验结果如下:1.通过将ATS1的氨基酸序列与多个物种的质体3-磷酸甘油酰基转移酶氨基酸序列进行比对分析,推测ATS1的转运肽序列为氨基端90个氨基酸残基。使用酵母遗传互补体系对截去氨基端90个氨基酸残基的ATS1进行酶活性分析,发现不带转运肽的ATS1可以恢复双突变体酵母因3-磷酸甘油酰基转移酶活性缺失导致的生长缺陷,表示不带转运肽的ATS1仍具有3-磷酸甘油酰基转移酶活性。此外,不带转运肽的ATS1在酵母中的酶活性要高于带转运肽的ATS1,说明此时不带转运肽的ATS1是一个成熟型蛋白。2.将带转运肽和不带转运肽序列的ATS1转入atgpat1突变体拟南芥中,虽然两种ATS1均未能回复atgpat1突变体雄性不育的异常表型,但是与atgpat1突变体相比,不带转运肽序列的ATS1转基因株系种子的含油量平均增加了13.5%,其中C18:1、C18:3和C20:1脂肪酸的相对含量显著增加,C18:2脂肪酸的相对含量显著减少,以上结果与带转运肽序列的ATS1转基因株系的种子油脂变化相似,说明不带转运肽的ATS1在拟南芥中仍然具有3-磷酸甘油酰基转移酶活性。3.构建两种ATS1的组成型表达载体,将他们分别导入到野生型拟南芥中。通过抗性筛选和DNA分子鉴定获得T_3代不带转运肽序列的ATS1过表达纯合单拷贝株系6株、T_3代带转运肽序列的ATS1过表达纯合单拷贝株系5株。荧光定量PCR分析发现,上述所有转基因株系中ATS1的表达量都高于空载转基因对照,从中选取4个高表达量的不带转运肽序列的ATS1转基因株系、3个高表达量的带转运肽序列的ATS1转基因株系用于后续实验的研究。4.对带转运肽序列和不带转运肽序列的ATS1过表达株系的叶片进行油脂分析。结果表明,与带转运肽序列的ATS1过表达株系相比,不带转运肽序列的ATS1过表达株系叶片中的C16:0、C16:3脂肪酸相对含量显著减少,C18:0、C18:2和C18:3脂肪酸相对含量显著增加;此外,不带转运肽序列的ATS1过表达株系叶片MGDG的脂肪酸组分与空载转基因对照没有差异。上述结果表明ATS1异位表达可以影响质体外甘油脂的从头合成。5.对带转运肽序列和不带转运肽序列的ATS1过表达株系进行了磷胁迫处理,发现在低磷胁迫下,两种转基因株系的根冠比及叶绿素含量都显著高于空载转基因对照,说明增强甘油脂从头合成可以减轻低磷胁迫对拟南芥造成的损伤。6.外源甘油供应会增加细胞内3-磷酸甘油的合成,使细胞内游离磷酸盐的含量下降,进而导致植物处于磷胁迫状态。为了进一步探究甘油脂从头合成对植物磷胁迫响应的影响,对带转运肽和不带转运肽序列的ATS1过表达株系进行了甘油处理。当供应0.01%(v/v)的甘油时,不带转运肽序列的ATS1过表达株系的主根长度显著长于带转运肽序列的ATS1过表达株系,暗示着增强质体外甘油脂从头合成可能提高了植物抵御磷胁迫的能力。上述研究结果表明,截去氨基端90个氨基酸残基的ATS1是一个成熟蛋白,其可以增强质体外甘油脂从头合成途径,进而有助于提高植物对耐磷胁迫的响应能力,但其中的具体机制还需要进一步的研究。
【图文】：

溶血磷脂酸,二酰甘油,3-磷酸甘油,胞嘧啶核苷

图 1.1 拟南芥甘油脂类的生物合成途径Figure 1.1 The pathways of glycerolipids biosynthesis in A. thaliana注：G-3-P：3-磷酸甘油；LPA：溶血磷脂酸；PA：磷脂酸；DAG：二酰甘油；CDP：胞嘧啶核苷二磷酸；PE：磷脂酰乙醇胺；PC：磷脂酰胆碱；PS：磷脂酰丝氨酸；PI：磷脂酰肌醇；PG：磷脂酰甘油；CL：心磷脂；PGP：磷脂酰甘油磷酸；MGDG：单半乳糖基甘油二酯；DGDG：双半乳糖基甘油二酯；Ser：丝氨酸；Etn：乙醇胺；EtnP：磷酸乙醇胺；MMEtnP：磷酸单甲基乙醇胺；DMEtnP：磷酸双甲基乙醇胺；CDP-MME：CDP-单甲基乙醇胺；CDP-DME：CDP-双甲基乙醇胺；PMME：磷脂酰单甲基乙醇胺；PDME：磷脂酰双甲基乙醇胺；Cho：胆碱；ChoP：磷酸胆碱。GPAT：3-磷酸甘油酰基转移酶；LPAT：溶血磷脂酸酰基转移酶；CDS：CDP-二酰甘油合成酶；PAH：磷脂酸磷酸酶；SDC：丝氨酸脱羧酶；EK：乙醇胺激酶；PECT：磷酸乙醇胺胞苷酸酰基转移酶；AAPT：氨基-醇磷酸转移酶；CCT：磷酸胆碱胞苷酰基转移酶；PSD：磷脂酰丝氨酸脱羧酶；CK：胆碱激酶；PEAMT：磷脂酰乙醇胺 N-甲基转移酶；PLMT：磷脂-N-甲基转移酶；PMEAMT：磷酸甲基乙醇胺-N-甲基转移酶；PGPS：磷脂酰甘油磷酸合成酶；PGPP：磷酸磷脂酰甘油磷酸酶；CLS：心磷脂合酶；PIS：磷脂酰肌醇合酶；MGD：单半乳糖甘油二酯合酶；DGD：双半乳糖甘油二酯合酶。Note: G-3-P: glycerol-3-phosphate. LPA: lysobisphosphatidic acids. PA: Phosphatidic acid. DAG: diacylglycerol. CDP:cytidyldiphosphate. PE: phosphatidylethanolamine. PC: phosphatidylcholine. PS: phosphatidylserine. PI:

跨膜运输,脂质

注： - 表示无数据。Note: - means no data.目前已知的大部分脂质转运模型都是通过研究酵母（Saccharomyces cerevisiae）得来的，对于植物细胞内脂质转运的研究还相对较少。总体而言，脂质运输可以分为以下四种模型：(A)单分子脂质的扩散（diffusion）；(B)利用脂质转运蛋白（lipidtransferproteins, LTPs）进行脂质分子的转运；(C)通过运输小泡（transport vesicle）将脂质分子从一层膜融合到另一层膜上；(D)膜与膜之间紧密接触（10-30nm）形成膜连接部位（membrane contact sites, MCSs），协助脂质分子的跨膜运输[4]（图 1.2）。微粒体（蓖麻） 47 31 14 2 4 2叶绿体（花椰菜） 55 6 14 - 23 2过氧化物酶体（蓖麻）54 29 10 2 3 2液泡膜（绿豆） 47 32 11 5 5 -细胞质膜（绿豆） 47 35 5 8 5 -
【学位授予单位】：浙江农林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q943.2;Q945.78

【参考文献】