胚胎干细胞无血清培养过程的研究
发布时间：2020-06-11 15:49
【摘要】：胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ESCs)具有自我更新和多向分化潜能,在科学研究和临床医学领域具有巨大的应用前景,但要实现其实际应用价值必须克服干细胞数量稀少的瓶颈问题,因此,亟需建立高效、可控的ESCs培养过程。为此,本文以鼠胚胎干细胞(Mouse embryonic stem cells,mESCs)为研究对象,首先考察了饲养层的制备方法、血清对mESCs扩增特性的影响。结果发现:采用丝裂霉素处理制备的饲养层支持mESCs扩增效果优于固定化饲养层;采用明胶代替饲养层同样能支持mESCs稳定扩增并维持未分化状态;培养基血清浓度达5%既能支持mESCs的扩增也能使其维持未分化状态,据此建立了以明胶为饲养层、血清替代物代替血清的mESCs的无血清培养体系,该体系中mESCs的扩增倍数可达到2.95±0.5倍,SSEA-1+细胞比例在80%以上。在此基础上,分别考察了GSK3、MEK及FGFR抑制剂三类小分子化合物种类及相互作用对mESCs扩增及全能性维持的影响。结果发现:与对照组相比,GSK3抑制剂(BIO及SB-216763)都能促进总细胞增殖,但会明显降低SSEA-1+细胞的比例;MEK和FGFR抑制剂均有利于mESCs的扩增;GSK3抑制剂SB-216763与MEK抑制剂(PD184352、PD0325901)或FGFR抑制剂(SU5402)中的一种或二种组合均可以促进mESCs的扩增;特别是SB-216763+PD0325901+SU5402组合不仅能促进总细胞扩增,还能显著提高SSEA-1+细胞比例,培养3代后总细胞扩增倍数和SSEA-1+细胞的比例可达318.78±47.95和80%以上明显高于对照组的38.89±18.44和70%左右(p0.05)。其次,采用转瓶在无血清培养体系中考察了mESCs在Cytodex3微载体上的扩增特性,培养到第5天时mESCs扩增倍数最大可达到31.68±7.74倍明显高于静态培养时的17.92±9.80(p0.05),SSEA-1+细胞比例在85%以上,且AKP染色及Oct4免疫荧光染色均呈阳性,实现了mESCs无血清无饲养层的动态悬浮培养。以上研究结果为胚胎干细胞的规模化制备技术的开发提供了依据。
【图文】：
宄表明ＭＥＦ分泌的对ｍＥＳＣｓ起作用的细胞因子主要为ＬＩＦ，血清和ＬＩＦ同时作用可以维持逡逑ｍＥＳＣｓ的自我更新［２６］。逡逑ＬＩＦ的作用机制如图１．１所示。培养基中添加ＬＩＦ后，ＬＩＦ可以与细胞膜上的受体逡逑ＬＩＦＲ／ｇｐｌ３０结合，从而激活细胞质内的ＪＡＫ邋（ｊａｎｕｓ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ邋ｋｉｎａｓｅ，邋ＪＡＫ），ＪＡＫa愃峄义虾蠼せ睿樱裕粒裕常ǎ螅椋纾睿幔戾澹簦颍幔睿螅洌酰悖澹颍箦澹幔睿溴澹幔悖簦椋觯幔簦铮颍箦澹铮驽澹簦颍幔睿螅悖颍椋穑簦椋铮睿常澹樱裕粒裕常瑬Ｋ峄义系模樱裕粒裕晨梢孕纬啥厶褰胂赴四诘鹘冢恚牛樱茫蠖嗄苄曰虻谋泶铮郑恚牛樱茫蟮腻义衔捶只刺郏常担荨＃蹋桑朴胂赴ど系氖芴澹蹋桑疲遥纾穑欤常敖岷弦材芄患せ罴せ盍字＜〈迹常ゅ义厦福ǎ穑瑁铮螅穑瑁铮椋睿铮螅椋簦椋洌澹常耄椋睿幔螅澹校桑常耍┬藕磐罚保常叮保校桑耍承藕磐房梢约せ睿粒耍缘谋泶铩ｅ义希校桑耍常粒耍孕藕磐房梢砸种铺窃铣擅讣っ福冲澹ǎ牵欤悖铮纾澹铄澹螅睿簦瑁幔螅邋澹耄椋睿幔螅澹常牵樱耍常郏常贰浚义喜⒌鹘冢危幔睿铮缁虻谋泶铮保常福荨５保危幔睿铮绻泶锸保梢源俳恚牛樱茫笤诿挥校蹋桑频那榭鱿乱插义夏芪治捶只刺郏常梗薄＃蹋桑埔材芄患せ钇渌男藕磐罚纾停粒校耍牛遥诵藕磐罚佣义霞せ钔庑藕诺鹘诩っ福ǎ牛簦颍幔悖澹欤欤酰欤幔蝈澹螅椋纾睿幔欤颍澹纾酰欤幔簦澹溴澹耄椋睿幔螅
本文编号：2708126
【图文】：
宄表明ＭＥＦ分泌的对ｍＥＳＣｓ起作用的细胞因子主要为ＬＩＦ，血清和ＬＩＦ同时作用可以维持逡逑ｍＥＳＣｓ的自我更新［２６］。逡逑ＬＩＦ的作用机制如图１．１所示。培养基中添加ＬＩＦ后，ＬＩＦ可以与细胞膜上的受体逡逑ＬＩＦＲ／ｇｐｌ３０结合，从而激活细胞质内的ＪＡＫ邋（ｊａｎｕｓ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ邋ｋｉｎａｓｅ，邋ＪＡＫ），ＪＡＫa愃峄义虾蠼せ睿樱裕粒裕常ǎ螅椋纾睿幔戾澹簦颍幔睿螅洌酰悖澹颍箦澹幔睿溴澹幔悖簦椋觯幔簦铮颍箦澹铮驽澹簦颍幔睿螅悖颍椋穑簦椋铮睿常澹樱裕粒裕常瑬Ｋ峄义系模樱裕粒裕晨梢孕纬啥厶褰胂赴四诘鹘冢恚牛樱茫蠖嗄苄曰虻谋泶铮郑恚牛樱茫蟮腻义衔捶只刺郏常担荨＃蹋桑朴胂赴ど系氖芴澹蹋桑疲遥纾穑欤常敖岷弦材芄患せ罴せ盍字＜〈迹常ゅ义厦福ǎ穑瑁铮螅穑瑁铮椋睿铮螅椋簦椋洌澹常耄椋睿幔螅澹校桑常耍┬藕磐罚保常叮保校桑耍承藕磐房梢约せ睿粒耍缘谋泶铩ｅ义希校桑耍常粒耍孕藕磐房梢砸种铺窃铣擅讣っ福冲澹ǎ牵欤悖铮纾澹铄澹螅睿簦瑁幔螅邋澹耄椋睿幔螅澹常牵樱耍常郏常贰浚义喜⒌鹘冢危幔睿铮缁虻谋泶铮保常福荨５保危幔睿铮绻泶锸保梢源俳恚牛樱茫笤诿挥校蹋桑频那榭鱿乱插义夏芪治捶只刺郏常梗薄＃蹋桑埔材芄患せ钇渌男藕磐罚纾停粒校耍牛遥诵藕磐罚佣义霞せ钔庑藕诺鹘诩っ福ǎ牛簦颍幔悖澹欤欤酰欤幔蝈澹螅椋纾睿幔欤颍澹纾酰欤幔簦澹溴澹耄椋睿幔螅
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