小麦F-box蛋白基因TaFBA1在ABA介导的植物干旱耐性中的功能

发布时间：2020-06-12 14:58

【摘要】：植物在生长发育中经常受到干旱胁迫的影响,加强植物耐旱机理的研究对提高植物的抗逆性和农作物的稳产、高产、优质具有重要意义。干旱胁迫下植物体内ABA水平上升,进而提高了植物抗逆性。F-box蛋白作为SCF型E3连接酶的关键亚基,在植物逆境耐性中具有重要功能,但小麦F-box蛋白与ABA调控的逆境耐性之间的关系尚不清楚。实验室前期克隆了小麦F-box蛋白基因TaFBA1。研究发现,TaFBA1过表达提高了转基因烟草的耐旱性,并且过表达TaFBA1烟草的气孔开度大,意味着TaFBA1在ABA调控的气孔关闭中起负调控作用。本文研究了TaFBA1在ABA介导的植物干旱耐性及气孔运动中的作用,并分析了其分子与生理机制。主要结果如下:(1)用基因组PCR和荧光定量PCR对TaFBA1过表达拟南芥、突变体和TaFBA1回补拟南芥进行筛选。选取过表达株系OE4、OE5、OE6,突变体atfbw2-4、atfbw2-5、atfbw2-6和回补株系R-4、R-5、R-6作为实验材料。(2)用甘露醇模拟干旱胁迫对各株系进行处理,同时添加ABA合成抑制剂Na_6WO_4,观察统计种子萌发、子叶转绿和幼根生长。结果显示,正常条件下各株系的这些指标无明显差异;干旱抑制了所有株系的种子萌发、子叶转绿和根系生长,但对过表达株系的抑制小于WT,对突变体的抑制大于WT;突变体中回补TaFBA1后,其干旱耐性明显提高。抑制ABA合成后,干旱处理对所有植株的抑制效应均有减轻,但没有改变各株系之间的差异。这些结果暗示TaFBA1可能没有参与ABA的合成。ABA含量检测的结果也证明了这一点。(3)对各株系的成苗进行自然干旱处理,检测植株生长和叶片光合能力。结果发现,干旱处理对成苗植株的影响与幼苗基本一致。正常条件下过表达和突变体株系的光合能力,包括气孔导度(Gs)、蒸腾速率(E)、净光合速率(Pn)、细胞间CO_2浓度(Ci)都无明显差异。干旱处理后,TaFBA1过表达株系的Gs、E、Pn都高于WT,突变体则反之;Ci无明显差异。结果表明TaFBA1过表达提高了拟南芥的光合能力。(4)用ABA处理各株系发现,过表达株系的种子萌发率和子叶变绿程度高、幼根伸长快、成苗长势好;突变体植株则反之;突变体回补TaFBA1能够降低突变体对ABA的敏感性。ABA处理条件下,TaFBA1过表达株系的光合能力强于WT,更强于突变体。这些结果说明TaFBA1过表达减轻了ABA处理对拟南芥植株的抑制效应。(5)特别值得注意的是,干旱和ABA处理条件下,TaFBA1过表达植株有较高的Gs。过表达植株的气孔关闭对ABA反应比较慢,突变体的气孔关闭对ABA反应比较快。说明过表达TaFBA1导致转基因植株的气孔关闭对ABA敏感性降低。(6)为了进一步探究TaFBA1调控ABA信号通路的分子机制,我们检测了ABA信号相关基因的表达,包括ABA信号响应基因和ABA合成相关基因。结果表明TaFBA1可调控ABA信号响应基因表达,但对ABA合成相关基因影响不大。气孔运动相关基因在过表达植株中均下调。这说明TaFBA1可能通过调控ABA响应和气孔运动相关基因的表达,进而参与气孔开关的调节。(7)以TaFBA1为诱饵,通过酵母双杂实验获得了两个与TaFBA1互作的蛋白,ABA受体RCAR1和转录因子ABI5。双分子荧光互补实验(BiFC)显示TaFBA1与RCAR1能够相互作用,互作位置可能在细胞膜上。(8)从生理生化水平分析了各株系的抗氧化能力。结果表明,干旱和ABA条件下,TaFBA1过表达株系中H_2O_2含量、O_2~·ˉ产生速率以及MDA含量均低于WT,突变体则反之,回补株系均低于突变体。说明过表达TaFBA1增强了ABA和干旱处理条件下转基因拟南芥的抗氧化能力。这可能是TaFBA1提高拟南芥耐旱性的重要原因。综上所述,小麦TaFBA1正向调节植物耐旱性,但与ABA生物合成无关。TaFBA1可能通过与RCAR1和ABI5相互作用,调控ABA信号通路相关的基因表达,进而负调节拟南芥对ABA的敏感性。增加抗氧化能力和减少活性氧积累可能是TaFBA1过表达转基因植株耐旱性提高的重要机制。
【图文】：

泛素,途径模式,蛋白酶体

小麦 F-box 蛋白基因 TaFBA1 在 ABA介导的植物干旱耐性中的功能 E1 激活，利用保守的 E1 催化半胱氨酸形成 E1-泛素(E1-Ub)与 E2 相互作用，，活化的泛素被转移到 E2 的活性位点半胱氨-泛素(E2-Ub)中间体。泛素转移到靶蛋白是由 E3 促进的，E作用，然后将泛素转移至底物的最佳结合位点，随后启动 Ub 素标记过的底物蛋白，它所要面临的就是被 26S 蛋白酶体识基酸重新进入代谢途径。泛素化途径的特异性主要受底物募集因此，E3 连接酶控制着众多的细胞过程，在整个泛素/26S 蛋重要的作用。

模式图,结构域,拟南芥,互作

重复序列）结构域、锌指结构、WD40（Trp-Asp重复序列）结构域、FBD结构域、ARM结构域、Kelch结构域以及最新发现的CRFA结构域、CRFB结构域、CRFC结构域等（如图1-3）。图 1-3 拟南芥中 F-box 蛋白 C 端互作结构域模式图（Gagne et al., 2001）Fig. 1-3 Model of F-box c-terminal Binding Protein Domain in Arabidopsis（Gagne et al., 2001）
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q945.78

【参考文献】