芽孢杆菌CDJYB来源角蛋白酶基因克

发布时间：2020-06-12 12:42

【摘要】：角蛋白主要存在于动物的毛发、鳞片、羽毛、蹄、角等部位,由于其分子间富含二硫键以及疏水氨基酸,角蛋白往往难以降解,角蛋白酶可以在较为温和的条件下高效降解角蛋白,使角蛋白得以被绿色环保的利用。角蛋白酶的作用底物广范,在食品、药品、清洁及皮毛加工等领域都有着应用价值。本文利用多序列比对和分子克隆的方法,筛选出了一株芽孢杆菌CDJYB的角蛋白酶(Keratinase)基因,并构建了重组质粒pET-28a-Ker,经诱导纯化得到角蛋白酶,并探究了其酶学性质及其在降解羽毛粉和羽毛中的应用。具体研究内容与结果如下:1.利用多序列比对,设计引物,克隆得到未知芽孢杆菌CDJYB的角蛋白酶基因,构建重组质粒pET-28a-Ker,在Escherichia coli BL21菌株中重组表达角蛋白酶。在最佳诱导温度20℃时,粗酶液中角蛋白酶酶活为389.7 U/mL。2.采用单因素法测定了重组角蛋白酶的最适反应pH为10、最适反应温度为50℃,该酶热稳定较差,在50℃及以上孵育一小时后酶活损失超过80%。Ca~(2+)、Mg~(2+)、Fe~(2+)、Co~(2+)、Ba~(2+)、Cu~(2+)、Zn~(2+)和Fe~(3+)等金属离子对角蛋白酶有着促进作用,其中Cu~(2+)和Co~(2+)对重组酶的促进作用尤其明显。以可溶性角蛋白为底物时,还原剂DTT(DL-Dithiothreitol)和GSH(Glutathione)能部分抑制角蛋白酶活性,表面活性剂也能抑制重组酶,其中SDS(Sodium dodecyl sulfate)的抑制效果超过70%,重组酶被低浓度PMSF(Phenylmethanesulfonyl fluoride,0.01%,w/v,mg/mL)强烈抑制,表明该酶是一种典型的丝氨酸蛋白酶,该酶对于磺化角蛋白的动力学参数V_(max)和K_m分别为62.5μg/(mL·min)和19.56 mg/mL。3.通过重组角蛋白酶降解羽毛粉和羽毛的应用研究发现:在角蛋白酶的作用下,羽毛粉(部分二硫键及其他化学键被破坏)在反应6 h时后,酪氨酸释放量为9.74 mg/g羽毛粉,达到酸法水解效果的39.4%;羽毛降解过程中DTT起着重要的作用,当反应中DTT浓度达到0.25%(w/v)时,其对角蛋白酶降解羽毛的促进效果达到最大(降解产物OD_(280)为0.37),降解效果为不含DTT组(降解产物OD_(280)为0.019)的19.5倍;其次使用脂肪酶和蒸煮预处理羽毛后,都能够加快角蛋白降解羽毛的速度,其中蒸煮法处理后效果显著,但是脂肪酶和蒸煮法混合处理的效果却没有好于单一蒸煮法。电镜扫描图片显示脂肪酶和蒸煮法预处理过后羽毛表面都变得更加粗糙,但经过蒸煮后的羽毛表面显得更加干燥蓬松。
【图文】：

角蛋白酶,氨基酸序列

并使用粉状角蛋白作为培养基中的唯一碳氮源，能够筛选产角蛋白酶的微生物，并挑选水解圈与菌落直径比值较大的菌落进行发酵测试，获得其中高产角蛋白酶的菌株。蒋彪等[17]通过这种筛选手段获得了一株高产角蛋白酶的菌株Bacillus sp.。1.1.2 角蛋白酶的分类按照蛋白酶活性中心分类[18]，角蛋白酶可分为三类，，分别为：丝氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶。其中丝氨酸蛋白酶类的角蛋白酶数量最多，应用也最为广，主要产自细菌，蛋白多序列比对发现这些微生物丝氨酸蛋白酶在多个区域高度保守，三联催化体 Asp、His、Ser 分别存在这些保守区域中，对于角蛋白的水解起到重要作用。金属蛋白酶类的角蛋白酶在细菌、放线菌和真菌中都有报道，其活性中心含有 Zn2+等二价金属，对于其催化功能行使重要作用。而一些角蛋白酶同时属于丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶，同时拥有以上两类酶的性质。天冬氨酸蛋白酶类的角蛋白酶目前只在人体腐生真菌 Candida albicans 中有发现，活性中心含天冬氨酸，这种蛋白酶是 Candida albicans 感染人体皮肤的作用因子[13-14]。

质粒图谱

pGEM-T质粒图谱
【学位授予单位】：湖北工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q936;Q78

【参考文献】