I-B-Svi型CRISPR-Cas系统在谷氨酸棒状杆菌中的基因编辑

发布时间：2020-06-16 10:12

【摘要】：谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)是一种不具有CRISPR-Cas系统的生产氨基酸的重要工业微生物,在发酵过程中会产生许多有用的代谢产物,如:谷氨酸、丁二烯等,在工业生产中有非常重要的地位。随着基因工程和基因编辑技术的快速发展,很多研究人员试图在基因水平上人工掌控微生物的生长和代谢,以使利益最大化。但因谷氨酸棒状杆菌与Cas9存在生物相容性问题(表达Cas9的菌株无法生长),目前CRISPR/Cas9系统无法直接应用于谷氨酸棒状杆菌的基因编辑中。基因组编辑技术(简称基因编辑技术)与常说的基因工程一样都是改变细胞的遗传特性,但不同点主要在于基因编辑技术直接针对细胞的染色体,从而使其功能远大于依靠载体的传统基因工程。CRISPR-Cas是原核中的适应性免疫系统,是最前沿的基因编辑技术,可对原核和真核细胞基因组中的基因进行缺失、插入、和替换,且具有简单、快速和有效的显著的优势。文献报道的能够进行基因编辑的方法主要包括2类II型(CRISPR/Cas9)和V型(Cpfl/Cas12a),尤以化脓链球菌中的II型CRISPR/Cas9系统应用最为广泛。但该系统也具有其局限性,如:脱靶和生物相容性等。I型CRISPR-Cas系统是自然界中最常见的类型,该系统中的Cas3在降解DNA时通常是逐步降解而不是直接产生双链断裂,这也可能是为什么I型CRISPR-Cas系统是自然界中最常见的原因。然而,迄今为止,除本实验室外,源自I型CRISPR-Cas系统的基因编辑工具未见报道。本实验室从化工制药厂的活性污泥中分离得到一株能够以甾体化合物为唯一碳源进行生长的放线菌,我们将其命名为:维吉尼亚链霉菌IBL14(Streptomyces virginiae IBL14),该菌株的全基因组测序分析发现:基因组上存在一个I-B-Svi型CRISPR-Cas系统。幸运的是:本实验室前期基于该系统的Cascade和单一的SviCas3已在该菌株自身、大肠杆菌和酿酒酵母中实现了基因编辑。本论文旨在研究SviCas3与谷氨酸棒状杆菌间的生物相容性,进而开发基于该菌株的基因编辑工具。实验中,我们构建了 2个蛋白表达质粒(pEC-XK99E-cas753;pEC-XK99E-cas3中起始密码子为ATG)和3个基因编辑质粒(pXMJ19-t/g-△ldh;pXMJ1 9-t/g-△ldh::egfp;pXMJ19-t/g-△ldh::cat),并通过两步电转化将蛋白表达质粒和基因编辑质粒分别电转至谷氨酸棒状杆菌电转感受中。验证结果表明:(1)含有直接来源于维吉尼亚链霉菌IBL14染色体中基因cas7、cas5和cas3的蛋白表达质粒pEC-XK99E-cas753结合基因编辑质粒可成功的对谷氨酸棒状杆菌进行基因组编辑(乳酸脱氢酶基因内部敲除了615 bp)。(2)仅含直接来源于维吉尼亚链霉菌IBL14染色体中单一cas3基因的蛋白表达质粒pEC-XK99E-cas3结合基因编辑质粒也能成功的对谷氨酸棒状杆菌进行基因组编辑(成功的将egfp、cat基因插入到乳酸脱氢酶内部)。(3)脱靶分析研究中未发现脱靶事件。(4)基于Cas9构建的、作为对照试验的基因编辑中没有得到谷氨酸棒状杆菌的转化子。总之:本论文(1)首次证实直接源于I-B-Svi型CRISPR-Cas系统中Svicas7-5-3基因的所开发的编辑工具能对该菌株进行基因组编辑,表明原核微生物中基因的碱基偏好要求不严;(2)首次证实了单一的未优化的SviCas3可对谷氨酸棒状杆菌的基因组进行编辑,表明在谷氨酸棒状杆菌中SviCas3比SpCas9生物相容性好;(3)潜在打靶位点的测序分析中未发现有脱靶现象,支持别人已发表的Cas3不参与靶序列定位的研究观点,暗藏着重要的应用前景。
【学位授予单位】：安徽大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q78
【图文】：

序列,谷氨酸棒状杆菌,乳酸脱氢酶,基因

谷氨酸棒状杆菌中的成功应用也避免了其他系统的干扰。逡逑乳酸脱氢酶基因总共编码３１６个氨基酸残基，该基因以ＡＴＧ为起始密码子。逡逑由图１－１可看出，在谷氨酸棒状杆菌中乳酸脱氢酶可以催化乳酸的产生，大大增逡逑加了谷氨酸棒状杆菌在发酵生产中的产物。本篇论文就是将谷氨酸棒状杆菌逡逑中的乳酸脱氢酶进行改造，将该基因完全敲除或在基因内部插入特定基因序列来逡逑千扰该酶的表达，从而达到代谢产物的累积。逡逑葡萄糖逡逑个逡逑甘油醛－３－磷酸逦乳酸逡逑个逦Ａ逡逑磷酸甘油邋ｋ￣￣邋ＮＡＤ＋逦丨、逡逑醛脱氢酶逡逑、，逦＿Ｈ，Ｈ＋—＾乳酸脱逡逑１，３＿二磷酸甘油酸逦氢酶逡逑个逡逑Ｖ逦Ｖ逡逑３－磷酸甘油酸邋＜—逦一丙酮酸逡逑图１－１靶基因代谢图逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－１邋Ｔｈｅ邋ｍｅｔａｂｏｌｉｃ邋ｍａｐ邋ｏｆ邋ｔａｒｇｅｔ邋ｇｅｎｅ逡逑１．２邋ＣＲＩＳＰＲ＿Ｃａｓ邋系统逡逑世界上存在很多种类的微生物，它们在繁殖时会受到噬菌体的侵染，噬菌体将逡逑细菌作为自己的宿主，在菌体内完成复制并且杀死细胞。所以，从细菌的角度来逡逑看

核苷酸序列,系统干扰,机制,亚型

逦Ｃ２ｃ２逦：？ｊ邋Ｃａｓｌ邋：邋Ｃａｓ２逡逑图１－２邋ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系统的分类与结构逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－２邋Ｔｈｅ邋Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ａｎｄ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ邋ｓｙｓｔｅｍｓ邋（ＬＳ：邋ｌａｒｇｅ逡逑ｓｕｂｕｎｉｔ；ＳＳ：邋ｓｍａｌｌ邋ｓｕｂｕｎｉｔ；邋Ａ邋ｐｕｔａｔｉｖｅ邋ｓｍａｌｌ邋ｓｕｂｕｎｉｔ邋ｔｈａｔ邋ｃａｎ邋ｂｅ邋ｆｕｓｅｄ邋ｔｏ邋ａ邋ｌａｒｇｅ邋ｓｕｂｕｎｉｔ逡逑ｏｆ邋ｓｅｖｅｒａｌ邋ｔｙｐｅ邋Ｉ邋ｓｕｂｔｙｐｅｓ邋ｉｓ邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄ邋ｂｙ邋ａｎ邋ａｓｔｅｒｉｓｋ；邋Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ邋ｏｐｔｉｏｎａｌ逡逑ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ邋ａｒｅ邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄ邋ｂｙ邋ｄａｓｈｅｄ邋ｏｕｔｌｉｎｅｓ：邋Ｔｈｅ邋ｑｕｅｓｔｉｏｎ邋ｍａｒｋ邋ｉｎｄｉｃａｔｅｓ邋ｔｈｅ逡逑ｃｕｒｒｅｎｔｌｙ邋ｕｎｋｎｏｗｎ邋ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ．）逡逑１．３邋１类Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系统的干扰机制逡逑Ｉ型系统由于ｃｍ基因的数量和排列不同又被分为六种不同的亚型［２３］。每个逡逑亚型都有不同，例如Ｉ－Ａ亚型的由１２个ｃｏｓ基因组成，而铜绿假单胞菌中的１－Ｆ逡逑亚型仅含有６个ｃｍ基因。尽管每个亚型存在差异，但所有Ｉ型系统都编码一种逡逑标志性的Ｃａｓ３蛋白以及普遍保守的Ｃａｓｌ蛋白｜２４邋２５］。尽管Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ阵列中的逡逑重复长度和序列在不同亚型之间是变化的，但重复内的核苷酸序列是部分回文的逡逑（除了亚型丨－Ａ）。在Ｉ型系统中，重复阵列被转录成前体ｃｒＲＮＡ邋（ｐｒｅｃｒＲＮＡ），逡逑其中重复的回文序列形成发夹

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