东北酸菜发酵过程亚硝酸盐微生物酶降解机制及应用

发布时间：2020-06-16 03:54

【摘要】：蔬果类发酵腌制食品可以通过微生物主导的亚硝酸盐酶降解和酸降解两种途径降低亚硝酸盐浓度。酸降解的研究较为透彻,广泛应用于发酵食品乳酸菌直投生产中。然而,酸降解不能消除过量农业氮肥施用造成的蔬果内高浓度的硝酸盐。这些硝酸盐进行人体后可被栖息于中性肠道的微生物还原,形成二次亚硝酸盐危害。因此,蔬果发酵腌制过程中,硝酸盐和亚硝酸盐的微生物酶降解机制的解析和应用具有重要意义。本论文以东北酸菜为对象进行发酵腌制模拟实验,参考氮素的生物化学地球循环途径和特征,通过对东北酸菜固体和发酵液液体理化性质、微生物转化氮素的功能基因丰度和细菌群落结构多样性的动态监测,明确东北酸菜腌制过程中亚硝酸盐酶降解的微生物途径和类群。同时,参考发酵液中酶降解底物的类型设计相应微生物特异性培养基分离具有酶降解功能的微生物菌株。最后进行多菌株的复合直投的初步试验。主要研究内容如下:(1)东北酸菜发酵过程亚硝酸盐酶降解途径研究。实验室模拟东北酸菜发酵条件进行了37天的连续动态监测。通过东北酸菜发酵液pH的动态监测将亚硝酸盐降解过程分为以酶降解为主的阶段(1-15天)和以酸降解为主的阶段(17-37天)。采用显色法、离子色谱法检测发酵液中氮素化合物(铵盐、亚硝酸盐与硝酸盐)浓度的动态变化。在酶降解阶段,亚硝酸盐浓度先逐渐升高,并在7天达到超过国标的峰值31.29mg/kg,然后下降至0.42 mg/kg。同时,检测到整个发酵过程中铵盐浓度变化较小且浓度远低于同时期的亚硝酸盐浓度,推测东北酸菜发酵过程中亚硝酸盐酶降解来源于微生物的反硝化作用。基于反硝化功能基因nir的实时荧光定量PCR检测,验证了上述结果同时明确了具有nirSC_1基因型、nirKC_5基因型与nirKC_2基因型的微生物类群在东北酸菜酶降解过程中发挥了重要作用。通过高效液相法测定反硝化作用底物有机酸结果表明,酸菜发酵前期反硝化微生物类群最可能利用的碳源包括草酸、苹果酸、柠檬酸、富马酸、琥珀酸、丙酸、酒石酸、乳酸8种。(2)东北酸菜发酵过程中亚硝酸盐酶降解微生物类群解析。通过构建东北酸菜不同时期发酵液样品的高通量测序文库,对发酵过程细菌群落结构多样性进行了解析。基于细菌OTU的文库稀释曲线、Chao1指数、Shannon指数、群落结构PCoA分析和物种注释等结果均表明东北酸菜发酵过程中,细菌群落结构发生明显演替过程。在亚硝酸盐酶降解阶段,假单胞菌目(Pseudomonadales)的假单胞菌属(Pseudomonas),乳杆菌目(Lactobacillales)的明串珠菌属(Leuconostoc)和魏斯氏属(weissella),以及肠杆菌目(Enterobacteriales)未知新种细菌最为优势,且这些优势细菌类群相对丰度伴随发酵液中硝酸盐和亚硝酸盐浓度的动态变化而改变,是东北酸菜发酵前期亚硝酸盐酶降解阶段关键微生物类群。(3)硝酸盐和亚硝酸盐酶降解微生物分离和鉴定。以硝酸盐和亚硝酸盐作为氮源底物,以上述8种有机酸混合作为碳源电子供体,以有氧和无氧为限制条件,培养分离得到发酵液中具有同时降解硝酸盐与亚硝酸盐能力的细菌菌株133株。经过反硝化能力检测确定来自肠杆菌目(Enterobacteriales)的肠杆菌属Enterobacter、金黄杆菌Chryseobacterium、劳特菌属Raoultella和欧文氏属Kluyvera,乳杆菌目(Lactobacillales)的肠球菌属和明串珠菌属的细菌菌株,具有同时降解硝酸盐和亚硝酸盐能力。另获得2株肠杆菌属和1株金黄杆菌属的新种菌株。(4)双重还原功能菌株的直投发酵应用。从安全性出发选择明串珠菌菌株Leuconostoc citreum FXLB-3S2和肠球菌Enterococcus casseliflavus NXBC-1S2作为同时具有硝酸盐和亚硝酸盐酶降解能力的菌株。辅助分离得到的乳杆菌Lactobacillus plantarum PXLB-1S1进行单菌直投与复合直投发酵实验。直投结果表明复合发酵可将东北酸菜固体硝酸盐降解率由75%提高至84%,液体中硝酸盐降解率可达48%,且发酵过程中无亚硝酸盐积累。
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TS255.53;TS201.3
【图文】：

生物地球化学,亚硝酸盐,酶降解

江苏大学硕士学位论文1.2 亚硝酸盐相关的微生物氮素循环亚硝酸盐是氮素生物地球化学循环的中心，其生成与降解途径多种多样，作用微生物也多种多样。生物地球化学循环中的氮素循环途径中，不同生成降解和途径中关键基因不同，反应底物与产物也均不相同。其中亚硝酸盐可能经过以下 4 种微生物代谢途径进行转化：1、反硝化作用（Denitrification）；2、硝酸盐氨化作用（Dissimilatorynitrate reduction to ammonium, DNRA）；3、厌氧氨氧化作用（Anammox）；4、硝化作用（Nitrification），反应式如图 1.1[22]。

微生物代谢,氧化还原反应,酸菜,电位

北酸菜发酵过程亚硝酸盐微生物酶降解机制及应对其他微生物的生长有抑制作用，从而忽略养基的设计是解析酸菜发酵过程中酶降解位较低，在微生物代谢过程中极易成为电子盐、亚硝酸盐转变为气态氮素释放（图 1.2同有机酸盐作为碳源，硝酸盐、亚硝酸盐作东北酸菜发酵过程中有机酸、硝酸盐、亚硝底物是酸菜发酵系统中微生物可利用的多种培养基可准确地分离酸菜发酵液中的亚硝酸

【参考文献】