表达多拷贝Thmg和Ggs1提高工程菌株解脂亚罗酵母YL-C1合成β-胡萝卜素

发布时间：2020-06-17 21:09

【摘要】：解脂亚罗酵母是生物合成β-胡萝卜素的理想菌株,目前本课题组已经利用解脂亚罗酵母成功构建了具有β-胡萝卜素合成能力的重组菌株,但还存在以下问题尚未解决,首先该重组菌株中所有基因均为游离表达,质粒和菌体不会同时进行复制,菌株的稳定性较差且β-胡萝卜素含量较低;其次用于解脂亚罗酵母中的基因工程技术效率较低。因此,本研究拟以解脂亚罗酵母作为底盘细胞工厂构建产β-胡萝卜素的稳定菌株,在此基础上通过调控代谢平衡提高β-胡萝卜素的含量,并在解脂亚罗酵母中对Crispr-cas9技术进行初步探索。主要研究内容和结果如下:(1)产β-胡萝卜素稳定菌株YL-C1的初步构建。通过在polf和产油菌株polf-mfe--pex10-中合成β-胡萝卜素筛选出最优宿主菌为polf,在中敲除Ku70基因提高同源重组的效率,在此基础上以Snf为靶点将基因Thmg,Ggs1,CarRA,CarB整合至敲除ku70基因的Y.lipolytica polf基因组中,构建了产β-胡萝卜素的稳定重组菌株,经过60代的传代重组菌株的稳定性下降缓慢,β-胡萝卜素的含量达到了2.34mg/g DCW。(2)调控关键基因Thmg、Ggs1的拷贝数提高β-胡萝卜素的含量。对Y.lipolytica polf(Δku70)中β-胡萝卜素代谢通路的中间产物HMG-CoA,FPP测定后发现,当菌体中含有2Thmg时,β-胡萝卜素的含量达到最高,为14.12 mg/g DCW,当菌株中含有1Ggs1时,β胡萝卜素的含量最高,为11.86mg/g DCW。(3)解脂亚罗酵母中Crispr-cas9体系的构建。通过对影响Crispr-cas9技术关键因素的研究发现敲除基因Ku70使同源重组的效率提高25%;最佳Donor DNA长度为100bp;Donor DNA浓度越高越好:打靶位点的评分系统中特异性分在100左右、推荐细胞中表达的指导分数在60左右,推荐用于体外转录的指导分数在40左右,框架内缺失的克隆百分比分数在40左右,脱靶效率为0时效果最佳。本研究构建了产β-胡萝卜素的稳定重组菌株YL-C1,对生物合成类胡萝卜素具有一定的指导意义;同时对解脂亚罗酵母中Crispr-cas9技术进行了初步探索,这为在解脂亚罗酵母中利用Crispr-cas9技术奠定了基础。
【学位授予单位】：陕西师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q93
【图文】：

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【参考文献】

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本文编号：2718167