耐辐射奇球菌PprI的GAF结构域功能初探
发布时间：2020-06-17 21:30
【摘要】：耐辐射奇球菌(Deinococcus radiodurans,DR)是一种具有极端抗性的微生物,对电离辐射(Ionizing radiation,IR)、紫外辐射、干旱、氧化胁迫和诱变剂等损伤因子均表现出极强的抗性,常作为研究DNA损伤修复的模式生物。耐辐射奇球菌的DNA损伤修复能力极强,这依赖于其高效的损伤修复途径。PprI蛋白被称为耐辐射奇球菌的辐射损伤响应开关,PprI-DdrO介导的DNA损伤响应途径与大肠杆菌中经典SOS响应机制有较大的差异,属于一种新型的损伤修复途径。而PprI作为这条途径的主角,发挥着至关重要的作用。PprI同源物IrrE的晶体结构已经解析,其中位于C端的GAF结构域功能尚未知晓。近年来的研究表明,GAF结构域主要在细胞内行使着信号分子受体的作用,说明其可能在PprI-DdrO介导的DNA损伤响应途径中发挥作用。以探究PprI的GAF结构域的功能为目的,开展了一系列研究,具体的实验结果如下:通过蛋白序列比对,揭示了 GAF结构域序列在同类菌株中具有同源性,通过解析PprI晶体结构并进行比对,进一步说明了 GAF结构域极为保守,研究这一结构域在奇球菌属中具有普适性;PprI是耐辐射奇球菌中响应损伤的关键蛋白,其主要包括:N端类锌指蛋白结构域、HTH结构域以及GAF结构域。敲除GAF结构域后,耐辐射奇球菌对UV和γ损伤的耐受性与野生型相比下降了两个数量级,几乎与PprI敲除株类似,表明GAF结构域对PprI完整功能至关重要;PprI可以通过切割转录抑制子DdrO,启动下游修复基因的表达。构建截短GAF结构域的PprI蛋白,以及GAF结构域蛋白,发现GAF结构域被截短后基本不会影响PprI蛋白的酶切活性;通过酵母双杂交检测GAF结构域在PprI与RNA聚合酶β亚基互作中的作用,发现截去GAF结构域影响PpIT176A与RNA聚合酶的互作能力,说明GAF结构域可能在RNA聚合酶β亚基的招募中发挥作用;比对 Deinococcus radiodurans 和 Deinnococcus deserti的 GAF 结构域,发现两者的GAF结构域都形成了一个类似空腔的结构,推测其可能会用于结合小分子信号物质,从而行使接受信号的功能;采用等温滴定量热法测定小分子cGMP、cAMP与GAF结构域的结合能力,结果表明,GAF结构域可以结合cGMP,不能结合cAMP;本研究通过一系列生理生化试验,初步探索了 PprI蛋白的GAF结构域在耐辐射奇球菌中的功能,证实GAF结构域通过影响RNA聚合酶的招募在耐辐射奇球菌紫外以及γ损伤抗性中发挥着重要作用,推测其可能是通过结合信号小分子cGMP来响应上游损伤。通过对该结构域的功能研究,为PprI-DdrO介导的DNA损伤响应途径上游响应机制研究奠定了基础。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q933
【图文】：
耐辐射奇球菌细胞外被与革兰氏阴性菌双层细胞膜的结构类似，但其肽聚糖逡逑层较厚，导致脱色较为困难，革兰氏染色呈阳性，因此被认为是一种革兰氏阳性逡逑菌。耐辐射奇球菌的细胞壁在电镜下可以分为六层（图１．２）邋［３，４］，细胞膜在最逡逑内层，其次是含有肽聚糖并且多孔的细胞壁，第三层是分区层，紧挨着分区层的逡逑是外膜，第五层是电子比较密集的区域；最外层由六角形蛋白分子单体（由ＳｌｐＡ、逡逑Ｈｐｉ等蛋白组成）规则排列而成，常被称为Ｓ层，这层结构极大地提高了细胞的逡逑刚性，在细胞膜与外界配体的结合中也发挥着重要作用；也有一些耐辐射奇球菌逡逑外层还有一层较厚的多糖外被［３，邋４］。逡逑—：！逡逑Ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ邋ｌａｙｅｒ邋．逦ＳＩｐＡ逦｜逡逑Ｐｅｐｔｉｄｏｇｉｙｃａｎ邋■逡逑图１．２耐辐射奇球菌细胞壁结构图［４］逡逑Ｆｉｇｌ．２邋Ｃｅｌｌ邋ｗａｌｌ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ａｃｔｉｎｏｃｏｃｃｕｓ邋ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ逡逑１．１．２耐辐射奇球菌基因组信息逡逑１９９９年Ｗｈｉｔｅ邋０等采用“随机全基因组鸟枪法”对耐辐射奇球菌Ｒ１的基因俎逡逑进行测序，结果表明，Ｒ１基因组总体大小为３．２８Ｍｂ［５］，由４个环状染色体组成，逡逑如图１．３，根据ＤＮＡ分子由大到小的顺序分别命名为：Ｉ号染色体（２，６４８，６３８ｂｐ）、逡逑ＩＩ号染色体（４１２
逦■■■0？？？逡逑；＾ｒ－逦４，２３４８邋０ｐ邋；逡逑图１．３耐辐射奇球菌基因组ＤＮＡ分子组成ｐ］逡逑Ｆｉｇｌ邋．３邋Ｇｅｎｏｍｅ邋ｏｆ邋Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ邋ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ逡逑１．２耐辐射奇球菌的辐射损伤抗性逡逑耐辐射奇球菌比较显著的一个功能特征就是辐射耐受性强，在Ｙ辐照下，８逡逑Ｇｙ／ｈ的剂量基本不影响其生长（图１．４Ａ图所示），在６０Ｇｙ／ｈ的辐射下仍＇可以逡逑缓慢生长，甚至可以在１５ＫＧｙ的电离辐射中存活，其辐射抗性是大肠杆菌的一逡逑千倍以上。除此之外，在干q妗ⅲ眨执硪约八苛衙顾卮淼燃颂跫拢头义仙淦媲蚓哪褪苄跃蠓雀哂诖蟪Ω司ㄍ迹保粗校隆ⅲ谩ⅲ耐妓荆ｅ义希铃危殄危洛义希苠澹咤澹咤澹幔颍铮洌簦铮洌酰妫幔睿椋蓿蓿掊危埃薄ⅲВВ危模颍幔簦龋铮洌酰簦铮铮翦义稀！卞澹苠危苠危茫希湾澹苠义稀福苠危苠澹椤＃海诲危苠义
本文编号：2718193
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q933
【图文】：
耐辐射奇球菌细胞外被与革兰氏阴性菌双层细胞膜的结构类似，但其肽聚糖逡逑层较厚，导致脱色较为困难，革兰氏染色呈阳性，因此被认为是一种革兰氏阳性逡逑菌。耐辐射奇球菌的细胞壁在电镜下可以分为六层（图１．２）邋［３，４］，细胞膜在最逡逑内层，其次是含有肽聚糖并且多孔的细胞壁，第三层是分区层，紧挨着分区层的逡逑是外膜，第五层是电子比较密集的区域；最外层由六角形蛋白分子单体（由ＳｌｐＡ、逡逑Ｈｐｉ等蛋白组成）规则排列而成，常被称为Ｓ层，这层结构极大地提高了细胞的逡逑刚性，在细胞膜与外界配体的结合中也发挥着重要作用；也有一些耐辐射奇球菌逡逑外层还有一层较厚的多糖外被［３，邋４］。逡逑—：！逡逑Ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ邋ｌａｙｅｒ邋．逦ＳＩｐＡ逦｜逡逑Ｐｅｐｔｉｄｏｇｉｙｃａｎ邋■逡逑图１．２耐辐射奇球菌细胞壁结构图［４］逡逑Ｆｉｇｌ．２邋Ｃｅｌｌ邋ｗａｌｌ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ａｃｔｉｎｏｃｏｃｃｕｓ邋ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ逡逑１．１．２耐辐射奇球菌基因组信息逡逑１９９９年Ｗｈｉｔｅ邋０等采用“随机全基因组鸟枪法”对耐辐射奇球菌Ｒ１的基因俎逡逑进行测序，结果表明，Ｒ１基因组总体大小为３．２８Ｍｂ［５］，由４个环状染色体组成，逡逑如图１．３，根据ＤＮＡ分子由大到小的顺序分别命名为：Ｉ号染色体（２，６４８，６３８ｂｐ）、逡逑ＩＩ号染色体（４１２
逦■■■0？？？逡逑；＾ｒ－逦４，２３４８邋０ｐ邋；逡逑图１．３耐辐射奇球菌基因组ＤＮＡ分子组成ｐ］逡逑Ｆｉｇｌ邋．３邋Ｇｅｎｏｍｅ邋ｏｆ邋Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ邋ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ逡逑１．２耐辐射奇球菌的辐射损伤抗性逡逑耐辐射奇球菌比较显著的一个功能特征就是辐射耐受性强，在Ｙ辐照下，８逡逑Ｇｙ／ｈ的剂量基本不影响其生长（图１．４Ａ图所示），在６０Ｇｙ／ｈ的辐射下仍＇可以逡逑缓慢生长，甚至可以在１５ＫＧｙ的电离辐射中存活，其辐射抗性是大肠杆菌的一逡逑千倍以上。除此之外，在干q妗ⅲ眨执硪约八苛衙顾卮淼燃颂跫拢头义仙淦媲蚓哪褪苄跃蠓雀哂诖蟪Ω司ㄍ迹保粗校隆ⅲ谩ⅲ耐妓荆ｅ义希铃危殄危洛义希苠澹咤澹咤澹幔颍铮洌簦铮洌酰妫幔睿椋蓿蓿掊危埃薄ⅲВВ危模颍幔簦龋铮洌酰簦铮铮翦义稀！卞澹苠危苠危茫希湾澹苠义稀福苠危苠澹椤＃海诲危苠义
本文编号：2718193
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/swxlw/2718193.html
教材专著
