桑花叶型矮缩相关病毒的RepA蛋白在烟草上诱导细胞死亡的机理研究

发布时间：2020-06-22 20:16

【摘要】：双生病毒是一类具有孪生颗粒形态的单链环状DNA病毒,广泛分布于全球50多个国家和地区,对番茄、木薯、棉花等多种草本植物造成毁灭性危害。近年来,随着高通量测序技术的发展,研究者们不断地从柑橘、葡萄、桑树和苹果等多种多年生木本植物中检测到了新的双生病毒。由于基因组比较小,编码的遗传信息有限,双生病毒需要依赖与植物复杂的相互作用才能完成复制、转录和移动等生活史。因此,研究双生病毒与植物的互作对于了解植物抵御病毒侵染的机制以及病毒的致病机理具有重要作用。桑花叶型矮缩相关病毒(Mulberry mosaic dwarf-associated virus,MMDaV)是从表现花叶和矮缩的桑树上分离的一种单组份双生病毒。由于生物学特性以及致病机理尚不明确,MMDaV被国际病毒分类委员会划分为双生病毒科的一个暂定种。本论文充分利用研究植物与病毒互作的模式植物——本氏烟,对MMDaV与植物的相互作用开展了以下研究:首先构建了MMDaV的侵染性克隆并将其接种本氏烟,发现MMDaV的侵染性克隆接种3天后在本氏烟上引起了类似过敏性反应的细胞死亡。进一步将MMDaV病毒链上编码的V1、V2、V3、V4和V5以及互补链上编码的C1(RepA)和C2(Rep)构建到含有GFP标签的植物双元表达载体,利用农杆菌介导的瞬时表达方法浸润本氏烟,发现MMDaV编码的RepA的表达在本氏烟上诱导了细胞死亡。为了明确RepA引起细胞死亡的相关功能域,利用生物信息学对RepA的序列和结构域进行了分析,构建了RepA的8个缺失突变体。通过农杆菌介导的瞬时表达试验,发现RepA的RCA motif是RepA在本氏烟上诱导细胞死亡所必需的。进一步利用激光共聚焦显微镜对RepA及其突变体的亚细胞定位进行分析,发现RepA定位于本氏烟表皮细胞的细胞核中,并且RepA的细胞核定位可能与其诱导的细胞死亡有关。在植物中,MAPK级联反应和茉莉酸等信号途径参与了植物对多种病原物的抗性。为了筛选参与RepA诱导的细胞死亡的寄主因子,利用病毒诱导的基因沉默技术对本氏烟中的NDR1、RAR1、COI1、CTR1、NTF6、WRKY1、NPR1和MEK2等8个基因进行沉默,之后在相应基因沉默的烟草上瞬时表达RepA,发现NDR1、RAR1、COI1、CTR1、NTF6、NPR1和MEK2等7个基因的沉默不影响RepA引起的细胞死亡的产生,而WRKY1沉默后抑制了RepA引起的细胞死亡。进一步在WRKY1沉默的植物上接种MMDaV的侵染性克隆,发现WRKY1的沉默也抑制了MMDaV侵染引起的细胞死亡。利用实时荧光定量PCR分析了RepA以及MMDaV接种后WRKY1的基因表达情况,发现RepA的表达或者MMDaV的侵染均显著上调了WRKY1的表达,推测MMDaV的RepA通过激活WRKY1的表达而引起了细胞死亡反应。
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S432.41
【图文】：

双生病毒,基因组结构,病毒

2玉米线条病毒属病毒是一类由叶蝉以持久性方式传播的单组份双生病毒。基因组是 2.6-2.8kb的单链环状 DNA 分子，病毒链含有 2 个 ORF (V1 和 V2)，分别编码衣壳蛋白 (Coat protein, CP)和运动蛋白 (Movement protein, MP)；互补链含有 2 个 ORF (C1 和 C2)，分别编码与复制相关的蛋白 (Replication associated protein A, RepA 和 Replication associated protein, Rep)。该病毒属病毒两条链之间还包含两个大小不同的基因间隔区，分别为大的基因间隔区 (Large intergenic region,LIR)和小的基因间隔区 (Small intergenic region, SIR)。LIR 中含有双生病毒复制所必需的 9 碱基保守序列“TAATATT↓AC”，SIR 中含有转录的终止信号。玉米线条病毒属病毒既能侵染单子叶植

病原物,植物,效应

为了反抗植物的 PTI 以达到成功侵染的目的，病原物也进化出多种方式，如干扰膜上受体MP 的识别，或者分泌一些效应蛋白来改变抗性信号或者抑制其防卫反应 (Dodds and Rath10)。如革兰氏阴性细菌通过水平基因转化和对鞭毛器官的适应，进化出一种 III 型分泌系TSS)，细菌可以通过 TTSS 将效应蛋白传送到寄主植物的细胞内，从而抑制 PAMP 介导的防应。丁香假单胞菌可以分泌 AvrPto、AvrRpt2 和 AvrRpm1 来抑制植物的 PTI。致病疫霉的效 Avr3a 通过与寄主的 CMPG1 E3 连接酶互作来抑制激发子诱导的细胞死亡 (Bos et al., 2010一旦病原物分泌的效应蛋白突破了寄主植物第一道防线-PTI，植物又会进化出第二道更专的免疫机制来识别效应子，进而引发效应子触发的免疫反应 (Effector-Triggered Immunity, suda and Katagiri, 2010)。寄主植物分泌抗性蛋白 (R 蛋白)，可以特异性识别细菌、真菌、卵病毒等病原物的效应蛋白，进而激活 ETI 反应。研究表明，很多 R 蛋白都含有核酸结合位BS)、富含亮氨酸重复结构域 (LRR)、卷曲螺旋区域 (CC) 和 Toll-白介素-1 受体 (TIR) 等结别负责对效应子的识别和信号转运等，进而抵抗病原物的侵染 (Cuietal.,2015)。几乎每一个基因组都会编码几百个 NB-LRRs 负责 ETI 的激活 (Hofberger et al., 2014)。图 1.3 植物与病原物的互作模式图 (Dangl et al., 2013)Fig. 1.3 Model diagram of plant and pathogen interactions

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