真菌第五家族纤维素酶的基因挖掘与分子改良研究

发布时间：2020-06-30 09:42

【摘要】：微生物纤维素酶可以将纤维素转化为可发酵的糖类,已被广泛应用在能源、饲料、造纸等多个行业。从微生物基因组中挖掘具有应用潜力的新型纤维素酶,并通过分子改良提高其应用性能具有重要意义。本研究以真菌Talaromyces leycettanus JCM12802、Bispora sp.MEY-1、Bispora antennata CBS126.38、Gloeophyllum trabeum CBS900.73、Stegonsporium opalus CBS125034为出发菌株,克隆表达了糖苷水解酶第五家族(GH5)纤维素酶及具有纤维素酶活性的膨胀素蛋白。基于蛋白不同结构层次的分析,采用半桶融合、二级结构单元替换、定点突变等技术,系统的研究了 GH5纤维素酶结构原件及特定氨基酸位点与酶功能之间的关系,阐明了纤维素酶的稳定性及催化机制。从上述5株真菌中成功克隆、表达了 7个GH5纤维素酶,获得重组蛋白TlCe15A,TlCe15B,BsCel5A,BsCel5B,GtCe15,SoCel5,BaCel5,其最适温度在 50-80℃ 之间,最适pH在3.0-5.0之间,为酸性纤维素酶。其中,TlCe15A和BsCel5B为嗜热纤维素酶,最适温度为80℃,在70℃ 下的稳定性较好。TlCe15B最适pH为3.0,在酸性条件下的稳定性较好。在催化底物多样性方面,上述7个蛋白均对Barley β-glucan、Lichenan、CMC-Na表现出高活性。其中,BsCel5B具有较高的纤维素酶活性(1164 U/mg)和甘露聚糖酶活性(2203 U/mg),其甘露聚糖酶活性高于目前报道的其他纤维素酶。SoCel5(最适温度 60℃)与来源于Talaromyces emersonii CBS394.64 的 TeEg15A(最适温度90℃)的序列一致性为51%,基于二者的二级结构特点,进行结构重组,构建10个杂合蛋白,H1-H10。其中H8和H9最适温度分别为80℃和70℃,在55℃下的半衰期分别达到亲本蛋白SoCel5的650和155倍。此外,H8和H9的比活值分别为 720U/mg 和 920U/mg,均高于两个亲本 SoCel5(350U/mg)和 TeEgl5A(600U/mg)。分子动力学模拟结果表明,N端区域中Arg52点与周围氨基酸的氢键作用力以及α2和a3结构之间的疏水堆积力对嗜热酶的热稳定性发挥重要作用,使蛋白结构在高温下保持稳定。将TeEg15A的N端半桶结构(βα)1-4和3/8桶结构(βa)1-3分别替换至BaCe15,构建两个杂合酶BaCe15127和BaCe15167,其比活性和催化效率提高了 1.0-6.7倍。结构模拟的结果表明,BaCe15127和BaCel5167催化通道整体构型较BaCel5发生明显变化,有利于底物的结合和产物的释放,同时催化残基之间的距离也分别缩小了 2.5A和1.8A,有利于对底物的切割。此外,TeEg15A的N端半桶结构还为杂合酶引入了更多的氢键作用力,促进酶与底物的结合。通过本研究,证明了 TeEgl5A的N端半桶结构对酶的催化活性的重要影响,同时成功的对BaCel5的催化效率进行了改良。对GtCel5的Asn233位点进行饱和突变研究,该位点参与loop 6上的发卡结构的形成。通过对突变体性质分析发现,N233G和N233A 比活力和催化效率较野生型提高了 26-70%。以TeEg15A和SoCe15作为对照研究,其突变体的活力结果为GlyAlaAsn,与GtCel5突变结果一致。同源建模、分子对接、分子动力学模拟技术分析结果表明,233位点间接地影响了催化残基Glu267周围的氢键作用力网络。此外,Ala和Gly为233位点增加了新的氢键作用力,其与底物的结合能也显著降低。该研究阐明了 loop 6区对GH5纤维素酶催化活性的影响机制。从T.leycettanus基因组中克隆了 1个具有纤维素酶活性的膨胀素编码基因,获得重组蛋白TlSWO。活性测定结果表明,TlSWO对β-1,4键连接的纤维素类底物具有降解能力,其最适pH为4.0,最适温度为60℃。以预处理的天然玉米秸秆PCS为底物,TlSWO与Trichodermalongibrachiatu来源的内切纤维素酶EGI之间的添加比例达到1.2:0.8时的协同效果最优。以磷酸溶胀微晶纤维素PASC以及高度结晶纤维素CNC为底物,TISWO与来源于T.reesei外切纤维素酶CBHI的协同转化效率分别提高了 9.6%和30%。通过该部分的研究使我们对真菌膨胀素蛋白有了新的认识。
【学位授予单位】：北京林业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q55
【图文】：

纤维素酶,糖苷,家族,水解酶

１．３．３．２邋ＧＨ５纤维素酶催化机制逡逑由于ＧＨ５是第一个报道有纤维素酶的糖苷水解酶家族，因此，也被称为“纤维素逡逑酶Ａ”家族（Ａｓｐｅｂｏｒｇ，２０１２）。该家族成员采取双交换催化机制，其催化原理如图１．４所逡逑示。逡逑５逡逑

氨基酸序列,纤维素酶,折叠片,螺旋结构

供体和质子受体均复位到初始状态，对其他糖苷键再进行相同的水解过程。逡逑１．３．３．３邋ＧＨ５纤维素酶的结构特点逡逑第５家族纤维素酶具有相同的结构，Ｓ卩（ｐｏ0８－ＴＩＭ桶状结构（图１．５），根据文献报逡逑道，约１０％的酶具有此类结构（Ｃａｒｓｔｅｎｓｅｎ邋ｄ邋NB，２０１２ｂ）。其结构特点是由８组ｐ折叠逡逑片和ａ螺旋结构单元通过ａＰ－ｌｏｏｐ连接而成，而每个结构单元包含一个（３折叠片和ａ逡逑螺旋结构（Ｐ0０，由ｐａ－ｌｏｏｐ连接。整体结构如图１．５所示，ＴＩＭ桶状结构的外围是８逡逑个ａ螺旋，内壁结构包含８个（３折叠片。ＧＨ５纤维素酶氨基酸序列包含７个保守的逡逑氨基酸残基，以来源于的ＢａＣｅｌ５为例，其保守氨基酸残基分别为逡逑Ａｒｇ６０，邋Ｈｉｓｌ０４，邋Ａｓｎｌ４３，邋Ｇｌｕｌ４４，邋Ｈｉｓ２１２，邋Ｔｙｒ２１４邋以及邋Ｇｌｕ２５４。其中邋Ｇｌｕｌ４４邋和邋ＧＷ２５４逡逑为该酶的催化残基

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