GH12家族糖苷水解酶Cel12A的功能研究

发布时间：2020-07-03 11:20

【摘要】：纤维素是地球上含量最多的可再生性资源,其天然结构稳定,在自然环境下降解缓慢。目前利用纤维素酶对纤维素资源进行酶法转化是人们研究的热点。本实验室前期从Bacillus licheniformis ATCC 14580菌株中克隆了GH12家族酶基因cel12A,并对其进行了初步的异源表达及酶学性质研究。本论文以此为基础,一方面对Cel12A的内切纤维素酶功能进行研究,通过序列比对和突变体构建确定了对酶活性具有重要作用的氨基酸位点,并对其可能的作用机制进行了深入研究。另一方面以Cel12A为对象,利用电子显微镜观察及协同作用实验等探讨了小分子量的GH12家族酶可能存在的非水解膨胀功能。本文的主要实验结果如下:(1)通过序列比对确定了GH12家族纤维素酶中可能与酶功能相关的15个保守氨基酸,对这些位点进行了丙氨酸筛选,突变体酶活性的测定结果显示这些氨基酸对Cel12A的活性具有不同程度的影响。亲核基团E155和酸碱催化基团E243突变后,重组酶活性完全丧失;D137突变后重组酶几乎丧失全部酶活性,暗示D137可能作为“催化三联体”的第三个成员发挥作用;此外N51A、W53A、Y89A及N133A突变体比酶活失活近80%,M157A与W159A突变体比酶活失活近70%,V86A与W139A突变体比酶活失活近60%,P167A与F245A突变体比酶活失活近30%,V199A和I189A突变体比酶活失活低于20%。(2)进一步对影响酶活性程度较大的N51、W53、Y89和N133四个位点的功能进行研究。对N51进行天冬氨酸D和丙氨酸A方向的突变,突变后酶的剩余活性均不足30%,显示出N51可能通过与底物结合形成氢键而发挥作用。对W53进行酪氨酸Y和组氨酸H方向的突变,突变后酶的剩余活性均不足30%,说明W53可能在GH12家族酶分子与底物识别与结合过程中发挥重要的作用。对Y89进行苯丙氨酸F方向突变,突变后酶基本维持原来的活性,推测在酶催化底物过程中Y89的作用是维持糖环正确的构象。对N133进行天冬氨酸D、苯丙氨酸F方向的突变,结果显示突变体后的酶活性呈梯度下降,表明N133与酸碱催化基团之间所形成的氢键是Cel12A识别与催化纤维素类底物的结构基础,同时,N133突变体最适pH向酸性方向偏转了近0.4个单位,暗示该位点能够影响催化残基的催化环境,进而对酶活性的维持及催化断键时的最适pH产生影响。(3)扫描电子显微镜观察到经Cel12A预处理的不溶性纤维素底物明显变得蓬松;同时也检测到Cel12A与商品化纤维素酶在与这些底物的作用过程中具有协同作用。这些实验结果表明Cel12A作为小分子量蛋白发挥了类似于植物ExPansin及Swollenin的膨胀功能。(4)为进一步探究Cel12A发挥膨胀功能的原因,以内切纤维素酶活性完全丧失的Cel12A失活突变体为材料进行了膨胀实验。结果显示,Cel12A失活突变体也能一定程度地发挥膨胀功能,但与野生型相比,膨胀功能有所下降,说明Cel12A具有膨胀功能的原因可能与其内切纤维素酶的活性及小分子蛋白的特性均具有相关性。本论文探讨了Cel12A的分子作用机制及非酶因子膨胀功能,为GH12家族纤维素酶的蛋白质工程改造及体外高效复合酶系的构建提供了理论和实验信息。
【学位授予单位】：东北师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q55
【图文】：

图.出.n.切臼

CD图 0-1 Cel12A 处理滤纸的扫描电镜照片Fig. 0-1 Scanning electron micrograph of filter paper treated by Cel12A: filter paper treated by Cel12A is enlarged 400 times; B: filter paper treated ffer is enlarged 400 times C: the filter paper treated by Cel12A is enlarged 16times; D: filter paper treated by buffer is enlarged 1600 times)AB

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本文编号：2739593