miR-451a、miR-210-3p在低氧下K562细胞向红系分化过程中作用机制的研究

发布时间：2020-07-06 10:35

【摘要】：目的:红系核心转录因子GATA-1,调控众多下游蛋白因子和microRNAs,推进正常红系分化进程。miR-451a作为红系特异性miRNA,受GATA-1调控参与红系分化过程;miR-210-3p受低氧调控明显,且与红系分化相关。本文将初步探讨低氧下GATA-1的表达变化情况以及GATA-1是如何通过调控miR-451a及miR-210-3p参与红系分化过程。方法:(1)结合联苯胺染色阳性细胞率、γ-globin的mRNA表达变化判断不同氧浓度下的细胞分化效率;(2)MTS细胞增殖实验检测细胞增殖的情况与流式细胞周期检测结果分析细胞增殖水平的变化;(3)Western blot检测GATA-1表达变化情况;(4)qRT-PCR检测miR-451a及miR-210-3p的表达变化情况;(5)结合联苯胺染色阳性细胞率、γ-globin的mRNA水平的变化判断过表达GATA-1后红系分化情况;(6)采用qRT-PCR检测过表达GATA-1后miR-451a及miR-210-3p的表达变化情况;(7)结合联苯胺染色阳性细胞率、γ-globin的mRNA水平的变化分别检测过表达miR-451a、过表达和抑制miR-210-3p后的红系分化情况;(8)采用Western blot检测过表达miR-451a后14-3-3ζ蛋白的表达水平、过表达及抑制miR-210-3p后Smad2蛋白的表达水平;(9)结合联苯胺染色阳性细胞率、γ-globin的mRNA水平的变化判断Smad2抑制后红系分化情况。结果:(1)联苯胺染色结果显示,1%O_2条件下72、96 h阳性细胞率明显高于常氧(P0.05);而3%O_2条件下常氧、低氧各时间点间无明显差异;γ-globin的检测结果显示,1%O_2条件下低氧96 h的表达水平高于常氧组(P0.05),而3%O_2条件下与常氧组无明显差异。(2)结合MTS及细胞周期检测结果发现,不同氧浓度下细胞的增殖水平与常氧组无明显差异(P0.05)。(3)Western blot检测结果显示,K562细胞经hemin诱导至72 h,低氧组GATA-1蛋白的表达水平显著高于常氧组(P0.05)。(4)qRT-PCR检测结果显示,hemin诱导K562细胞至96 h,miR-451a及miR-210-3p均表现出明显的低氧高于常氧的变化趋势(P0.05)。(5)当GATA-1过表达后,联苯胺染色阳性细胞率及γ-globin的表达水平均显著高于NC组(P0.05)。(6)过表达GATA-1后,miR-451a及miR-210-3p表达均高于NC组(P0.05)。(7)过表达miR-451a及miR-210-3p后,联苯胺染色阳性细胞率及γ-globin的表达水平显著高于NC组(P0.05);抑制miR-210-3p后联苯胺染色阳性细胞率及γ-globin的表达水平在常氧条件下显著低于NC组(P0.05),低氧条件下则与NC组无明显差异。(8)Western blot检测14-3-3ζ蛋白表达结果显示,当miR-451a过表达后,其蛋白水平出现明显降低(P0.05),且低氧条件下降低更为明显;Western blot检测Smad2蛋白表达结果显示,当miR-210-3p过表达后,其蛋白水平与NC组对比出现明显降低(P0.05);当miR-210-3p抑制后,其蛋白水平与NC组对比出现明显上升(P0.05)。(9)抑制Smad2在K562细胞中的表达后,联苯胺染色阳性细胞率及γ-globin的表达水平较NC组均出现明显升高(P0.05)。结论:(1)低氧下GATA-1表达水平显著升高,可上调miR-451a的表达,抑制下游靶基因14-3-3ζ,发挥促红系分化的作用。(2)GATA-1可与miR-210-3p的启动子区域直接结合。(3)低氧下GATA-1上调miR-210-3p的表达水平,进而可能通过下调Smad2的表达促进红系分化。
【学位授予单位】：青海大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R329.2
【图文】：

氧浓度,常氧,青海大学,性细胞

青海大学硕士学位第 3 章实验结果第 3 章实验结果3.1 氧浓度的筛选3.1.1 不同氧浓度对分化的影响3.1.1.1 联苯胺染色检测阳性细胞率如图 1、2 和表 1、2 所示，不同氧浓度下联苯胺染色阳性细胞率表明，组不同时间点间，阳性细胞率均呈上升趋势（P＜0.05）；1%O2浓度下各时间点性细胞率显著高于常氧组（P＜0.05），而 3%O2浓度下则与常氧组无明显差异＞0.05）。

常氧,低氧,阳性率,细胞

图 2 3%O2联苯胺染色结果（100×）Figure 2 3%O2benzidine staining results (100×)表 2 经 hemin 诱导后常氧组和 3%低氧组联苯胺染色细胞阳性率（ x±SD）Table 2 Cell positive rates of benzidine staining in the normoxia group and the 3% hypoxic group after hemininduction（ x±SD）组别 n 24h(%) 48h(%) 72h(%) 96h(%) F P常氧组 3 3.70±0.42 37.43±0.53#50.91±1.85#57.85±0.45#1701.386 0.0003%低氧组 3 4.04±0.05 40.89±4.05#54.85±0.95#59.76±1.96#360.269 0.000t -1.392 -1.330 -3.281 -1.645P 0.236 0.254 0.03 0.175注：#P＜0.05 vs 24 h，*P＜0.05 vs 常氧组

氧浓度,检测结果,细胞增殖

图 3 不同氧浓度下 γ-globin 的 qRT-PCR 检测结果（ x±SD，#：P＜0.05 vs 组内，*：P＜0.05 vs 组间，左为 1%O2，右为 3%O2）Figure 3 The detection of γ-globin by qRT-PCR at different oxygen condition（ x±SD，#：P＜0.05 vs intra-group，*：P＜0.05 vs inter-group,left is 1%O2,right is 3%O2）.2 不同氧浓度对增殖的影响.2.1 MTS 细胞增殖实验检测细胞增殖水平变化为探讨不同氧浓度对细胞增殖的影响，筛选合适造模条件，采用 MTS 细殖实验检测。实验结果如图 4 所示，不同氧浓度下细胞增殖率与常氧组无明异（P＞0.05）。

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